禽腺病毒血清4型的分离鉴定及其灭活疫苗的初步研究

摘要

心包积液综合征（Hydropcricardium hepatitis syndrome，HHS）主要是由Ⅰ群禽腺病毒血清4型（Fowladenovirus serotype 4，FAdV-4）引起的，2015年该病在我国多个省份暴发并成区域性流行，迄今为止国内没有有效的防控手段预防该病，因此给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。　　本研究从92份疑似感染禽腺病毒的病料中共分离到69株FAdV-4，分离率为75%。对该69株FAdV-4的hexon基因进行鉴定、测序、序列相似性分析和系统发育进化分析后，结果显示分离毒株与国内已报道的FAdV-4代表毒株亲缘关系最近，序列相似性为 100%，但与国外 FAdV-4 代表毒株亲缘关系较远，序列相似性在 98.9%~99.1%之间。氨基酸序列分析结果显示，分离毒株与国外代表毒株的hexon蛋白氨基酸序列相比，共9个氨基酸突变位点，分别为188 I~R、193 Q~R、195 E~Q、238 N~D、240 A~T、243 E~N、410 T~A、797 A~P和842 G~A，这些突变位点主要分布于hexon蛋白的前段与中段，而前段与中段是hexon蛋白的主要抗原位点，因此提示国内暴发的FAdV-4可能发生了抗原表位的改变。　　本研究根据分离时间、地点及临床发病特点选定了HZ-06-01 F7分离株为代表毒株进行 FAdV-4 的致病性研究。为研究该毒株的致病特点，将该病毒在鸡肝癌细胞（LMH）上传代及蚀斑纯化，并对该病毒的全基因组进行测序及分析，最后通过动物回归试验来研究该病毒的致病特点。全基因组系统发育进化分析结果表明 HZ-06-01分离毒株与中国代表毒株HB1510、JSJ13属于同一分支且亲缘关系最近，说明该分离毒株具有一定的代表性。序列比对发现， HZ-06-01 分离毒株与国外代表毒株MX-SHP95、NC_015323.1（该毒未命名）相比，存在ORF19和ORF27基因的缺失。攻毒试验表明，HZ-06-01经不同攻毒途径攻毒对鸡的致病性存在差异，其中肌肉注射组死亡率为 100%（10/10），且在病死鸡的多个脏器中均能检测到病毒；灌喂组死亡率为0%（0/10），但攻毒后第2周能检测到抗体；病理组织学观察可见肝脏有明显的核内包涵体、脾脏淋巴细胞减少等典型病变。　　通过对FAdV-4的分离、鉴定、筛选及筛选株的致病性分析后，HZ-06-01筛选株与国内FAdV-4代表毒株亲缘性较近，且可以复制出典型的HHS，因此选定HZ-06-01 F7为种子毒株进行FAdV-4灭活疫苗的初步研究。遗传稳定性分析结果表明，HZ-06-01的F7、F50和F100代毒株的hexon、penton、fiber1、fiber2等结构蛋白基因较为保守，序列相似性为100%，但非结构蛋白基因dUTPpase 、PTP、33KDa、100KDa及ITR发生了序列突变。疫苗质量检测结果表明，成品疫苗无污染、接种3周龄SPF鸡后无不良反应且接种部位吸收良好；免疫保护性试验结果表明，对3周龄SPF鸡，以最小剂量25 μL 经肌肉注射途径免疫2次后，第8周攻毒，能够有效预防HZ-06-01 F7病毒的攻击，保护率为100%（5/5）。抗体消长规律试验结果表明，以250 μL 的成品疫苗1次免疫3周龄SPF鸡后，第7周SPF鸡仍具有较高的FAdV-4血清抗体水平（≧4461.478）。因此HZ-06-01毒株可以做为候选株进行FAdV-4灭活疫苗的进一步的研究。

目录

第一个书签之前