CRISPR/Cas9技术在改良玉米籽粒赖氨酸含量的应用

摘要

玉米(Zea mays L.)作为全球主要三大粮食作物之一，必需氨基酸的缺乏是影响玉米营养品质的关键因素。其中赖氨酸是玉米重要的限制性氨基酸，提高玉米籽粒赖氨酸含量也是玉米育种的长期目标之一。本课题利用CRISPR/Cas9编辑技术，对编码玉米赖氨酸代谢酶(Lysine Ketoglutarate Reductase/Saccharopine Dehydrogenase，LKR/SDH)的基因ZmLKR进行编辑，以期改良玉米籽粒的赖氨酸含量。
　　本研究主要内容包括：⑴根据C01玉米自交系ZmLKR基因序列，构建了2个CRISPR/Cas9编辑载体，通过农杆菌介导的转化，将这两个编辑载体导入C01自交系，分别获得113和121个 T0代独立转化事件，测序分析显示 ZmLKR基因在54％的事件中被成功编辑。编辑植株通过自交，转基因位点从部分T1代植株中成功分离，获得转基因-free、ZmLKR基因单位点和双位点编辑(纯合或者杂合)的植株，遗传分析显示编辑位点能够稳定遗传。⑵选取其中3个T1代突变体植株，对其叶片和籽粒的总氨基酸、游离氨基酸含量进行测定分析。结果发现ZmLKR突变体叶片中的游离赖氨酸含量显著提高，由对照的24.47?g/g，增加到42.58?g/g-46.94?g/g，增幅在74%-92%之间；籽粒游离赖氨酸含量由0.05 mg/g显著提高到0.2 mg/g-0.25 mg/g左右(增加3倍以上)；籽粒总赖氨酸含量由对照的0.28 mg/g提高到0.42 mg/g-0.52 mg/g，增幅达50%-85%；突变体籽粒中总赖氨酸含量占总蛋白质组分的0.4%以上，达到Quality Protein Maize(QPM)标准。这些结果表明，利用CRISPR/Cas9编辑技术失活ZmLKR基因是一条快速改良玉米植株和籽粒营养品质的途径。

目录

声明

缩略语表

1前言

1.1玉米种子蛋白的营养品质

1.2高赖氨酸玉米的研究进展

1.3玉米的遗传转化方法

1.4 CRISPR/Cas9系统

1.5 CRISPR/Cas9技术的应用进展

1.6 CRISPR/Cas9系统的最新研究进展

1.7本研究的目的与意义

2实验材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3实验结果与分析

3.1 玉米CRISPR/Cas9编辑体系测试结果

3.2玉米ZmLKR编辑实验结果

4结果分析与讨论

4.1利用CRISPR/Cas9基因编辑技术快速获得玉米突变体

4.2失活玉米ZmLKR基因显著提高玉米籽粒营养价值

5主要结论

参考文献

附录1 pZmLKR1、pZmLKR2载体示意图

附录2 T0代的ZmLKR编辑序列

附录3 氨基酸测定数据

致谢