基于茶树鲜叶离体失水转录组的CsSnRK2s和CsADC基因鉴定与功能分析

摘要

茶树是我国重要的经济作物之一，持续的干旱、低温等非生物胁迫都会影响茶叶的产量和品质，为了筛选茶树与抗旱性相关的重要基因并进一步解析失水逆境信号转导调控的分子网络，本研究通过茶树鲜叶离体失水转录组测序分析，锁定了ABA信号转导通路中的重要蛋白激酶SnRK2s以及多胺代谢关键酶精氨酸脱羧酶(ADC)，并进一步通过酵母双杂交检测二者分别与转录因子CsICE1的互作关系，同时采用qRT-PCR测定了离体失水条件下，不同茶树品种中以上基因的表达情况，得到的主要研究结果如下:
　　1、通过茶树鲜叶离体失水转录组数据分析发现，获得的测序数据拼接质量较高，clean data共计104.12 G，unigene共计233131个。其中值得关注的是，差异基因KEGG富集分析发现:ABA信号转导通路相关基因在茶树鲜叶离体失水3h、12h和24 h时均显著上调表达。
　　2、在“鄂茶1号”茶树品种中，克隆获得CsICE1、CsSnRK2.1、CsSnRK2.6、CsSnRK2.8和CsADC5个基因的cDNA序列，生物信息学分析结果表明:5个基因的ORF分别为1587 bp、1077 bp、1027 bp、1035 bp和2163 bp;编码氨基酸数目分别为:528、358、342、344和720;疏水性和跨模性分析结果表明:这5个基因编码的蛋白质全部都为亲水性蛋白质，且均不跨膜;系统进化树表明，CsSnRK2的3个成员分别属于CsSnRK2亚家族的三组;CsADC与番木瓜CpADC的同源性较高;多序列比对分析和蛋白质结构域预测分析结果表明:CsICE1包含bHLH结构域，CsSnRK2s包含Ser/Thr结构域， CsADC包含Orn-DAP-Arg-deC结构域和Orn-DAP-Arg-2吡哆醛-脯氨酸结合位点;蛋白质二级结构的结果表明:CsICE1、CsSnRK2s及CsADC均由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲构成;磷酸化位点分析表明:CsICE1、CsSnRK2s及CsADC均具有多处Ser、Thr和Tyr磷酸化位点;亚细胞定位在线预测分析结果表明:CsSnRK2s主要存在于细胞质和细胞核，CsICE1主要存在于细胞核，CsADC主要存在于细胞质。
　　3、酵母双杂交实验结果表明:转录因子CsICE1全长具有自激活性，短截片段CsICE1-73和CsICE1-146均不具有自激活性，且与CsSnRK2.6和CsADC均不发生互作。
　　4、相对表达量分析结果表明:CsSnRK2.1、CsSnRK2.8、CsICE1和CsADC在4个品种中经脱水胁迫处理后，其上调基本不超过3倍，下调不低于原来的1/3。但CsSnRK2.6的相对表达量在黔辐4号中上调最为明显，脱水胁迫处理3h后，CsSnRK2.6的表达量就上调超过了5倍，脱水胁迫处理9h时，其表达量就上调超过了16倍，但在脱水胁迫处理12h后，其表达量呈下调趋势，且下调量不明显，而在鄂茶10号、紫娟和鄂茶1号中，CsSnRK2.6的上下调表达量基本不太明显。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 植物应对非生物逆境胁迫的分子机理

1．1 胁迫的感知与信号转导

1．3 转录因子的调控

2 ABA与非生物逆境胁迫

2．1 ABA依赖型响应非生物逆境胁迫信号网络

2．2 ABA不依赖型响应非生物逆境胁迫信号网络

2．3 ABA调控通路中的重要因子

3 植物SnRK蛋白激酶家族研究进展

3．1 植物SnRK1亚家族研究进展

3．2 植物SnRK2亚家族研究进展

3．3 植物SnRK3亚家族研究进展

5 精氨酸脱羧酶基因ADC研究进展

6 茶树CsICE1、CsSnRK和CsADC研究进展

6．1 茶树CsICE1的研究进展

6．2 茶树CsSnRK的研究进展

6．3 茶树CsADC的研究进展

7 高通量测序技术在植物研究上的应用

8 问题的提出及研究思路

第二章 鄂茶1号鲜叶离体失水的转录组分析

1 引言

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 茶鲜叶离体失水过程中的含水量变化

3．2 茶鲜叶离体失水过程中POD活性的变化

3．3 转录组测序原始数据分析

3．4 转录组数据组装及基因功能注释

3．5 GO注释

3．6 KOG注释

3．7 差异表达分析

3．8 差异基因KEGG富集分析

3．9 植物激素信号转导途径相关差异基因分析

3．10 qRT-PCR验证RNA-Seq数据

4 讨论与结论

第三章 茶树蛋白激酶CsSnRK2s、CsADC的克隆及生物信息学分析

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．2 CsICE1、CsSnRK2s和CsADC的生物信息学分析

4 讨论与结论

4．1 CsSnRK2s、CsICE1和CsADC基因的克隆

4．2 结论

第四章 蛋白互作分析

1 引言

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1“诱饵”载体的构建

3．2“诱饵”载体的自激活性检测

3．3“猎物”载体的构建

3．4 蛋白互作分析

4 讨论与结论

4．1 “诱饵”载体自激活检测

4．2 CsICE1与CsSnRK2．6的蛋白互作

4．3 CsICE1与CsADC的蛋白互作

4．4 结论

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

4 讨论与结论

附录

学习期间取得的成果

参考文献

致谢