枳转录因子PtrERF36在枳中的抗寒功能研究

摘要

枳(Poncirus trifoliata(L.) Raf.）是重要的柑橘砧木，具有较强的抗寒性，故常作为抗寒研究的重要材料。AP2/ERF是植物系统特有的一类转录因子大家族，越来越多的研究表明该家族的一些成员参与了植物生长发育、病菌防御以及非生物胁迫在内的多种生物学过程，但大部分成员的功能却并不清晰。本文以实验室克隆的PtrERF36基因为研究对象，旨在揭示该基因在枳抗寒中的功能和初步抗寒机制，主要研究结果如下:
　　1、构建Ptr ERF36-RN Ai载体，通过根癌农杆菌介导法转化，获得了202棵枳再生植株，PCR鉴定出29株阳性转基因株系，阳性转化率为14.36％，对6个PtrERF36干涉株系的表达量进行分析，发现干涉株系的表达量不同程度地低于野生型，其中＃47、＃56株系抑制程度最为明显。
　　2、对野生型和干涉株系＃47、＃56进行抗寒性分析，结果表明0℃处理12h后，干涉系植株受到更为严重的伤害，电导率、MDA及活性氧（H2O2和O2-）含量均高于野生型。POD、SOD酶活性低于野生型。上述结果表明PtrERF36被抑制后使枳的抗寒性减弱，推测PtrERF36可能在枳的抗寒性中起着正调控的作用。
　　3、qRT-PCR分析枳PtrERF36-RNAi系中胁迫相关基因的表达量，发现正常生长条件下，干涉系中POD、CAT、SOD、COR15以及ICE1等基因的表达水平均低于野生型。低温处理后上述基因表达量有所增加，但干涉系仍低于野生型。其中POD下调最为明显，分析POD基因的启动子发现上面含有能与ERF类转录因子结合的GCC-box，推测POD可能与PtrERF36有直接的调控关系。
　　4、以野生型枳的DNA为模板，PCR克隆获得PtrERF36的启动子序列，测序后分析表明，PtrERF36启动子序列含有ABRE、DRE/CRT等与胁迫应答相关的顺式作用元件。

目录

声明

摘要

缩略词表

1、前言

1．1 课题的提出

1．2 文献综述

1．2．1 植物抵御低温胁迫的生理机制

1．2．2 ERF转录因子的研究进展

1．2．3 RNA干涉技术在基因功能研究中的作用

1．2．4 启动子的研究进展

1．3 本研究的目的和意义

2．1 材料

2．2 方法

2．2．1 PtrERF36-RNAi干涉载体的构建

2．2．2 农杆菌介导PtrERF36-RNAi转化枳

2．2．3 PtrERF36-RNAi阳性植株鉴定

2．2．4 阳性植株转基因表达分析

2．2．5 转基因植株低温处理及生理指标鉴定

2．2．6 PtrERF36启动子克隆及分析

3 结果与分析

3．1 PtrERF36-RNAi转基因植株的获得

3．2 转基因植株PtrERF36表达量分析

3．3 PtrERF36-RNAi枳植株抗寒性分析

3．3．1 低温处理后表型及电导率和MDA测定

3．3．2 DAB和NBT染色分析ROS含量

3．3．3 低温处理后POD、CAT以及SOD活性分析

3．4 干涉系中胁迫应答基因表达分析

3．4．2 干涉系中低温相关基因表达量分析

3．5 PtrERF36启动子克隆以及元件分析

4 讨论

4．1 PtrERF36抗寒功能的初步验证

4．2 作用机制分析

4．3 PtrERF36启动子相关元件分析

参考文献

附录

致谢