Cloning,Expression,and Functional Analysis of Two Acetylcholinesterase Genes in Spodoptera Litura

摘要

斜纹夜蛾（Spodoptera litura）是一种为害蔬菜和观赏性植物的世界性杂食性害虫。因斜纹夜蛾食性杂、具有长距离迁徙能力、世代多、繁殖能力强及易对农药产生抗性等特点，导致其防治困难。乙酰胆碱酯酶(AChE，EC3.1.1.7)在突触后膜催化水解递质乙酰胆碱(ACh)导致神经冲动终止，是有机磷酸酯(OP)和氨基甲酸酯(CB)两类杀虫剂的主要作用靶标。因此本研究克隆了2种斜纹夜蛾乙酰胆碱酯酶基因（SlAce1和SlAce2），分析了这两个基因在斜纹夜蛾不同发育阶段和不同组织的表达水平;同时利用RNAi技术对SlAce1和SlAce2基因进行干扰，并对其分析生物学功能和表达模式进行分析。探究斜纹夜蛾Ace基因的功能为斜纹夜蛾的防治提供新思路。其主要研究结果如下:
　　本文克隆了斜纹夜蛾2个乙酰胆碱酯酶基因（SlAce1和SlAce2）。序列分析表明:SlAce1 cDNA全长为2085bp，编码694个氨基酸残基;SlAce2 cDNA全长为1917bp，编码639个氨基酸残基。SlAce1和SlAce2都含有特定氨基酸—催化三联体、阴离子胆碱结合位点、氧离子空穴、酰基口袋、外周阴离子亚位点以及活性丝氨酸残基的“FGESAG”功能域和催化区的14个保守芳香族氨基酸。SlAce1的分子模型与冈比亚按蚊、禾谷镰孢APAChEs的活性位点几乎完全相同，且在活性位点的开口处含有Cys432。氨基酸序列同源性分析结果显示:SlAce1基因的氨基酸序列与棉铃虫(87％)的相似度最高，与其它昆虫的相似度在65％-69％之间;SlAce2基因的氨基酸序列与棉铃虫ace-2基因(97％)相似度最高，与其它昆虫的相似度在49％-78％之间。进化分析表明:SlAce1属于AChE1家族，SlAce2属于AChE1家族，SlAce1与棉铃虫(HaAce1)和家蚕(BmAce1)的同源性最高，而SlAce2则与家蚕(BmAce2)和烟粉虱（BtAce2）的同源性最高。qRT-PCR实验结果表明SlAce基因在所有发育时期和组织中均有表达，且在脑部表达量最高。注射dsRNA后，斜纹夜蛾6龄幼虫中SlAcel和SlAce2基因的表达水平成功被抑制，并导致其死亡率分别为47.3％和37.9％。
　　利用RNAi技术成功沉默Ace2的表达可导致斜纹夜蛾的繁殖力、孵化显著降低，从而使斜纹夜蛾的后代明显减少。对照组的产卵率为100％，孵化率高达90％，而注射dsSlAce2后产卵率为27.9％，孵化率为36.5％，且育蛹率和羽化率分别为0.94％和7.54％;雄虫注射dsGFP和雌虫注射dsSlAce2后产卵率为47.5％，孵化率为40.5％，育蛹率和羽化率分别为1.3％和10％;但雄虫注射dsSlAce2和雌虫注射dsGFP后产卵率和孵化率分别增加至88.6％和88.4％。由此可见SlAce2可能在雌性繁殖、胚胎发育及后代发育过程与乙酰胆碱和非胆碱能功能的水解密切相关，而SlAce1可能在非胆碱能功能中有其它的作用。研究结果为斜纹夜蛾的生物防治提供分子基础，为新型农药的开发研制提供理论依据。

目录

声明

CONTENTS

Abstract

摘要

Chapter 1．LITERATURE REVIEW

1．1．1 Lepidopteran insect pests

1．1．3 Common Name

1．1．4 Classification

1．1．5 Economic importance

1．1．6 Morphology

1．1．7 Life cycle

1．1．8 Insecticide Resistance in Spodoptera litura

1．1．9 Plant-Insect Interactions

1．2 Acetylcholinesterase

1．2．1 Distribution of Acetylcholinesterase

1．2．2 Insecticide Target Sites and Structural Biology of Acetylcholinesterase

1．2．3 Acetylcholinesterase insecticide Resistance Mechanisms

1．2．4 Gene encoding acetylcholinesterase in insects

1．3 RNA interference

1．3．1 RNA interference

1．3．2 A short history of the innovation of RNAi

1．3．3 RNAi Pathways and Mechanism

1．3．4 Use of RNAi

1．4 RNAi in insects

1．4．1 Preliminary RNAi trials in insects

1．4．2 Study on the function of insect genes using RNAi methods

1．4．3 Techniques of dsRNA transfer to Insects

1．4．4 Use of RNAi in insect pest control strategies

1．4．5 Susceptibility to RNAi

1．5 Objectives of the study

Chapter 2．Cloning and expression of two Ace genes in Spodoptera litura

2．1 Introduction

2．2 Materials and Methods

2．2．1 Laboratory Equipment

2．2．2 Reagents and Expression vectors

2．2．3 Other Reagents

2．3 Methods

2．3．2 Insects

2．3．3 RNA extraction

2．3．4 First Strand cDNA Synthesis

2．3．6 Purification of DNA using DNA Gel Extraction Kit

2．3．7 DNA ligation with pGEM-T Easy Vector

2．3．8 Transformation of plasmid DNA into Bacteria host(E．coli)

2．3．9 Bacteria PCR

2．3．10 Phylogenetic analysis

2．3．11 SlAce genes expression pattern in different developmental stages and tissues

2．3．12 Statistical analysis

2．4 Results

2．4．1 Sequence analysis of Spodoptera litura AChE genes

2．4．2 SlAce genes expression profiles in S．litura

2．5 Discussion

2．6 Conclusion

Chapter 3．Functional analysis of two Ace genes in Spdoptera litura

3．1 Introduction

3．2 Methods

3．2．1 dsRNA synthesis and application

3．2．2 SlAce knockdown determination using qRT-PCR

3．2．3 Statistical analysis

3．3 Results

3．3．1 Gene silencing through larvae injection of dsSlAce

3．3．2 Injection with dsRNA delays pupation and emergence

3．3．3 dsAce2 injection affects egg laying，egg hatching and progeny development

3．4 Discussion

References

Appendix

Scientific Publications

Acknowledgements