利用CRISPR/Cas9技术编辑青鳉tyr和nanog基因

摘要

CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫系统，经人工改造后可对靶基因进行修饰的技术，具有构建方法简单、效率高、成本低、使用范围广等优点。目前，该技术已经成功应用于细菌以及多种动植物的基因组精确修饰中，是最具有临床应用前景的基因编辑技术。Nanog基因作为诱导多能性干细胞关键因子之一，对胚胎早期发育和维持胚胎干细胞全能性具有重要的作用。本实验以青鳉为研究对象，通过使用斑马鱼密码子优化的Cas9编码序列，对青鳉tyr和nanog基因进行基因编辑。实验结果表明斑马鱼密码子优化的CRISPR/Cas9系统可以高效率敲除青鳉tyr和nanog基因，而且通过同源重组机制也可以介导青鳉nanog基因敲入。总而言之，青鳉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立为研究青鳉nanog基因功能奠定重要的基础。
　　主要研究结果如下:
　　(1)使用CRISPR/Cas9系统，采用单靶点方式敲除青鳉tyr基因。在F0代可以观察到眼睛部位有明显的色素缺失，并通过连续自交和表型筛选的方式快速获得了能够稳定遗传的青鳉白化品系。
　　(2)使用CRISPR/Cas9系统，采用双靶点敲除方式敲除青鳉nanog基因，测序结果表明nanog基因约有900bp片段缺失。通过PCR筛选，我们获得了3种不同突变类型的F2代纯合突变体。将F2代纯合突变体自交，观察F3代胚胎发育情况，实验结果表明F2代纯合突变体自交产生的F3代胚胎在发育到囊胚晚期后停滞发育。
　　(3)使用CRISPR/Cas9系统介导青鳉nanog基因敲入。通过荧光观察和测序分析，实验结果表明Hyg-EGFP敲入片段精确整合到nanog基因靶点位置。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 CRISPR／Cas9系统研究进展

1．1．1 CRISPR／Cas9系统简介

1．1．2 CRISPR／Cas9系统介导的基因编辑

1．1．3 CRISPR／Cas9系统在鱼类中的应用

1．2 模式生物青鳉简介

1．3 Tyr基因简介

1．4 Nanog基因简介

1．5 本研究的主要内容、目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验用鱼

2．1．2 质粒和感受态细胞

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要试剂

2．1．5 主要试剂配制

2．1．6 主要生物学分析软件

2．2 实验方法

2．2．1 青鳉显微注射

2．2．2 构建zCas9质粒

2．2．3 青鳉tyr敲除

2．2．4 青鳉nanog敲除

2．2．5 Donor vector构建

2．2．6 青鳉nanog敲入

3 结果与分析

3．1 zCas9质粒构建与验证

3．2 青鳉tyr基因敲除结果

3．2．1 敲除靶点设计及敲除效率分析

3．2．2 青鳉tyr敲除表型分析

3．3 青鳉nanog基因敲除结果

3．3．1 nanog敲除双靶点设计及检测

3．3．2 nanog敲除F0代筛选结果

3．3．3 nanog敲除F1代杂合子筛选结果

3．3．4 nanog敲除F2代纯合子筛选结果

3．3．5 nanog敲除F2代纯合子自交结果

3．3．6 F3代胚胎nanog基因表达检测

3．4 Donor vector构建结果

3．4．1 5HA、2AHygEGFP、3HA片段PCR扩增结果

3．4．2 pHyg 5HA-2A EGFP质粒验证

3．4．3 pHyg HA-2A EGFP质粒验证

3．5 青鳉nanog敲入结果

3．5．2 青鳉nanog敲入验证结果

4 讨论

参考文献

6 附录

致谢