声明
摘要
缩略语表(Abbreviation)
1文献综述
1．1溶瘤病毒
1．1．1单纯疱疹病毒(HSV-1)
1．1．2伪狂犬病毒(PRV)
1．2溶瘤病毒的溶瘤机制
1．3溶瘤病毒的抗癌特异性
1．4溶瘤病毒的安全性
1．5肿瘤细胞特异性标签的选择
1．6基因编辑技术
1．6．1基因编辑技术的进展
1．6．2第一代基因编辑技术
1．6．3第二代基因编辑技术
1．6．4 CRISPR／Cas9技术
1．7 Cre／Lox重组系统的特性及应用
2研究目的与意义
3材料和方法
3．1材料
3．1．1病毒和细胞
3．1．2主要酶和试剂
3．1．3载体与质粒
3．1．4培养基与抗生素及其制备
3．1．5主要缓冲液、试剂及其制备
3．1．6感受态细胞制备试剂
3．1．7低熔点琼脂糖噬斑实验试剂制备
3．2方法
3．2．1限制性内切酶反应
3．2．2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
3．2．3 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3．2．4氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
3．2．5转化连接产物或质粒载体
3．2．6质粒载体的构建和鉴定
3．2．7碱裂解法小量抽提质粒
3．2．8 PRV-WT重组毒的鉴定
3．2．9细胞培养
3．2．10细胞lipo2000转染
3．2．11重组病毒的单细胞分选
3．2．12低熔点琼脂糖挑斑纯化
3．2．13病毒的增殖、收获和保存
3．2．14病毒基因组DNA提取
3．3．2 PRV-WT-△TK-△gE对骨髓瘤生长的抑制及小鼠存活期的观察
4结果与分析
4．1 PRV基因缺失毒株的构建及验证
4．1．2 TK、gE基因同源重组片段的质粒构建
4．1．3构建gE、gE双基因缺失重组毒PRV-WT-△TK-△gE-mCherry-GFP
4．1．4重组病毒PRV-WT-△TK-△gE-mCherry-GFP的纯化
4．1．5重组病毒PRV-WT-△TK-△gE-mCherry-GFP的鉴定
4．1．6利用Cre／Lox重组系统敲除荧光蛋白基因
4．1．7重组病毒PRV-WT-△TK-△gE的纯化和鉴定
4．1．8 PRV重组毒的溶瘤效果
4．2 HSV-1重组毒的构建
4．2．1 sgRNA的设计及其表达载体构建和鉴定
4．2．2同源重组质粒的构建及鉴定
4．2．3验证肿瘤特异性启动子的活性
4．2．4利用CRISPR／Cas9系统构建HSV-1重组毒
4．2．5 HSV-1-△γT34．5-mCherry重组毒的纯化
5讨论
6结论
参考文献
致谢
