中国红豆杉细胞紫杉醇合成期特异表达基因的cDNA克隆

摘要

详尽了解紫杉醇生物合成的分子基础和遗传调控机制,从而在分子水平实现对紫杉醇合成代谢的人工调控,将是发展先进的生物工艺大量生产紫杉醇的前提.上述工作的第一步即需要探测和分离紫杉醇生物合成相关基因或主基因,这是研究紫杉醇合成代谢规律和诱导子作用机理的重要切入点,也是实现分子水平上的代谢调控的切入点.该文以悬浮培养的中国红豆杉细胞株E2为实验材料,运用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)比较了红豆杉细胞紫杉醇合成期与非紫杉醇合成期基因的表达差异,回收和克隆紫杉醇合成期特异表达的基因片段,并对其中的部分进行了测序和序列同源性分析,为寻找和分离紫杉醇生物合成相关基因奠定了坚实基础.

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1 mRNA差异显示技术及其应用

1.1.1 DDRT-PCR技术基本原理和实验程序

1.1.2 mRNA差异显示技术的改进

1.1.3 mRNA差异显示技术的应用

1.2植物细胞大规模培养生产紫杉醇的研究现状及其面临的问题

1.2.1高产优良细胞系的选择

1.2.2培养条件和培养方法的优化

1.2.3代谢调节

1.2.4面临的问题

1.3紫杉醇生物合成途径和参与酶

1.3.1紫杉醇的生物合成途径

1.3.2紫杉醇生物合成途径中的催化酶

1.4本文研究目的和内容

2材料与方法

2.1材料

2.1.1细胞株和菌株

2.1.2培养基

2.1.3引物

2.1.4主要药品与试剂

2.1.5溶液的配制

2.1.6主要仪器设备

2.2方法

2.2.1红豆杉细胞培养和同步化外理

2.2.2紫杉醇含量测定

2.2.3 RNA样品制备

2.2.4逆转录PCR

2.2.5序列胶展示

2.2.6差异条带的回收

2.2.7逆向Northern杂交

2.2.8差异片段的克隆

2.2.9 Northern杂交

2.2.10 DNA测序与同源性分析

3结果与分析

3.1羟基尿的浓度和处理时间与红豆杉细胞分裂指数的关系

3.2红豆杉细胞紫杉醇合成期与非紫杉醇合成期的确定

3.3红豆杉细胞总RNA的纯度和完整性评价

3.4红豆杉细胞紫杉醇合成期与非紫杉醇合成期mRNA差异显示

3.5差异条带回收

3.6逆向Northern杂交

3.7差异片段克隆

3.8 Northern杂交

3.9序列测定及序列分析

4讨论

4.1使用mRNA差异显示技术分离红豆杉细胞紫杉醇生物合成相关基因

4.2关于实验中所采用的相关技术方法的讨论

4.3 TS4全长基因的功能预测

4.4对今后工作的设想

致谢

参考文献

附录1 DNA测序图谱

附录2在读期间正式接受和已发表的论文