同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞生物学特性影响及其作用机制的实验研究

摘要

第一部分人脐动脉血管平滑肌细胞培养与鉴定 目的：建立人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)体外培养模型。 方法：运用改良的植块贴壁法体外培养VSMCs；在倒置显微镜下进行细胞形态学观察并对培养的细胞进行α-actin免疫组化鉴定。 结果：培养的细胞生长良好，光镜下呈长梭形及“峰与谷”样生长。α-actin免疫组化的结果显示培养的细胞具有典型的VSMCs特征。 结论：改良植块贴壁法能使VSMCs原代培养的时间明显缩短，传代后VSMCs生物学特征的稳定性好，成功建立了人血管平滑肌细胞(VSMCs)体外培养模型。 第二部分同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞增殖、细胞周期分布及cyclinA、cyclinB1表达影响 目的：观察同型半胱氨酸(Hcy)对人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响，并探讨其机制。 方法：采用MTT方法检测Hcy诱导VSMCs增殖情况；采用流式细胞仪检测细胞周期；采用RT-PCR方法检测细胞周期蛋白A(cyclinA)和细胞周期蛋白B1(cyclinB1)mRNA的表达。 结果：1、体外培养的人脐动脉VSMCs在终浓度为100、200、500、1000μmol/LHcy的培养液中孵育24h后的A值均高于对照组(P＜0.05)，表明Hcy呈浓度依赖性诱导人VSMCs增殖； 2、体外培养的人脐动脉VSMCs在终浓度为0(对照组)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培养液中孵育24h后的S期细胞百分数分别为12.2％、17.0％、24.2％、32.8％、41.4％，表明Hcy能增加VSMCsS期细胞百分数； 3、体外培养的人VSMCs在终浓度为0(对照组)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培养液中孵育24h后的cyclinAmRNA相对表达量分别为0.66±0.01、0.79±0.04、0.87±0.02、1.07±0.03和1.18±0.04，cyclinB1mRNA相对表达量分别为0.55±0.02、0.68±0.02、0.89±0.05、1.28±0.01和1.41±0.02，表明Hcy呈浓度依赖性显著诱导人VSMCscyclinA和cyclinB1基因的表达。 结论：1、Hcy可以诱导人脐动脉VSMCs增殖，而且呈浓度依赖性； 2、Hcy诱导人脐动脉VSMCs增殖，使S期VSMCs细胞百分数增加，可能与其诱导cyclinA和cyclinB1基因表达有关。 第三部分同型半胱氨酸诱导人血管平滑肌细胞凋亡及其机制探讨 目的：研究同型半胱氨酸(Hcy)对人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的影响，并探讨其机制。 方法：用透射电镜观察经Hcy诱导人脐动脉VSMCs凋亡的形态学改变；用琼脂糖凝胶电泳测定DNAladder；采用流式细胞仪检测细胞凋亡率；采用RT-PCR检测bcl-2、bax及caspase-3mRNA表达变化。 结果：1、200-1000μmol/L浓度Hcy能明显诱导人脐动脉VSMCs凋亡，产生凋亡细胞所具有的典型形态学及生化特征； 2、体外培养的人脐动脉VSMCs在终浓度为0(对照组)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培养液中孵育24h后的细胞凋亡率分别2.68％±0.23％、2.79％±0.12％、8.45％±2.41％、13.37％±4.71％、23.75％±5.56％，表明Hcy呈浓度依赖性诱导人VSMCs细胞凋亡； 3、体外培养的人脐动脉VSMCs在终浓度为0(对照组)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培养液中孵育24h后的baxmRNA相对表达量分别为0.86±0.01、0.92±0.03、1.51±0.02、1.82±0.03、1.91±0.02，bcl-2mRNA相对表达量分别为1.38±0.04、1.32±0.03、1.28±0.03、1.21±0.02、1.09±0.02，表明Hcy呈浓度依赖性诱导人VSMCsbax基因表达显著上调，bcl-2基因表达轻度下调，bax/bcl-2比值升高； 4、体外培养的人脐动脉VSMCs在终浓度为0(对照组)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培养液中孵育24h后的caspase-3mRNA相对表达量分别为0.24±0.08、0.29±0.10、0.89±0.26、1.37±0.24、1.82±0.53，表明Hcy呈浓度依赖性诱导人VSMCscaspase-3基因表达显著上调。 结论： 1、Hcy可诱导人VSMCs凋亡，其作用呈剂量相关性； 2、Hcy诱导人VSMCs凋亡的机制可能是通过下调bcl-2基因表达及上调bax基因表达来实现的，此外，caspases-3也可能参与了细胞凋亡的调节。 第四部分同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞表达组织因子途径抑制物-2的影响 目的：观察同型半胱氨酸(Hcy)对人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)表达组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)的影响。 方法：采用RT-PCR方法检测Hcy对人VSMCsTFPI-2mRNA表达的变化；采用WesternBlot方法检测Hcy对人VSMCsTFPI-2蛋白表达的变化。 结果：1、体外培养的人脐动脉VSMCs在终浓度为0(对照组)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培养液中孵育24h后的TFPI-2mRNA相对表达量分别为0.96±0.07、0.86±0.05、0.73±0.07、0.56±0.04和0.45±0.07，表明Hcy呈浓度依赖性抑制人VSMCsTFPI-2基因的表达； 2、体外培养的人脐动脉VSMCs在终浓度为0(对照组)、100、200、500、1000μmol/LHcy的培养液中孵育24h后的TFPI-2蛋白相对表达量分别为1.22±0.20、1.09±0.12、0.87±0.15、0.71±0.098和0.54±0.183，表明Hcy呈浓度依赖性抑制人VSMCsTFPI-2蛋白的表达。 结论：Hcy以浓度依赖性的方式抑制了人脐动脉VSMCs表达TFPI-2，提示Hcy以浓度依赖性的方式抑制人脐动脉VSMCs表达TFPI-2可能是其致AS的机制之一。

目录

前 言

第一部分人脐动脉血管平滑肌细胞培养与鉴定

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第一部分附图

第二部分同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞增殖、细胞周期分布及cyclinA、cyclin B1表达影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分附图

第三部分同型半胱氨酸诱导人血管平滑肌细胞凋亡及其机制探讨

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分附图

第四部分同型半胱氨酸对人脐动脉血管平滑肌细胞表达组织因子途径抑制物-2的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分附图

综述同型半胱氨酸与急性冠状动脉综合症

附录一英文缩略词表

附录二攻读博士学位期间发表的文章

致谢