人ⅠκBαM真核表达载体的构建及其在大鼠肝移植缺血再灌注损伤中的作用

摘要

研究背景与目的：肝脏移植是终末期肝病患者目前唯一有效的治疗方法，但仍有诸多问题尚待解决：如何提高移植肝的活性、移植肝与受体的匹配、术后缺血再灌注损伤、免疫抑制药物的应用以及移植肝的再生和影响因素等。其中肝脏移植后缺血再灌注损伤是早期的急性损伤，导致肝脏功能的损害、加重排斥反应的强度，甚至引起移植后原发性无功能。核转录因子κB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)是近年来研究较为深入的调节细胞基因转录的一种关键因子。NF-κB调控的基因编码急性时相蛋白、细胞因子和细胞粘附分子等。通过调控多种基因的表达，NF-κB参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物进程。研究表明，肝移植缺血再灌注损伤过程中，NF-κB的激活导致其下游基因的转录表达，即炎性介质的大量表达，从而在移植后缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用。因此，可以设想抑制NF-κB的激活有望调节或减轻缺血再灌注损伤。 细胞在静息状态下，NF-κB以无活性的潜在状态存在于细胞浆中，它与一类抑制因子IκB(IκBs)结合组成为一异源三聚体。其中p50-p65-IκBα或IκBB是NF-κB/IκB结合的主要形式。三聚体中IκB家族抑制因子的存在可阻碍p50，p65复合物的核易位及DNA结合能力，从而使NF-κB的活性丧失。当细胞受到TNF，PMA等NF-κB激活剂刺激时，，激活IκB激酶(IκBkinase，IKK)，IKK催化IκBs的Ser32/36磷酸化后，随之泛素化及酶解。IκBs从三聚体中解离出来，暴露出p50亚基上的易位信号和p65亚基上的DNA结合位点，从而使此异二聚物表现出NF-κB活性，并从细胞质中易位到细胞核中，与κB基序(κBmotif)相结合，从而发挥转录调控作用。 研究表明IκBα的Ser32/36两个磷酸化位点任一个或两个位点同时发生点突变，可使IκBα不被IKK磷酸化及降解，从而特异性的结合NF-κB，阻遏NF-κB的异常激活。因此，我们应用重叠延伸PCR技术点突变人IκBα丝氨酸(Ser36)为丙氨酸(Ala36)，构建真核表达载体PcDNA3.0-IκBαM，在大鼠肝移植过程中将PcDNA3.0-IκBαM转染供体肝脏，观察PcDNA3.0-IκBαM对大鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用。 材料和方法： 1.研究对象：健康雄性SD大鼠，体重200-250g。 2.研究方法：稳定建立大鼠肝移植模型。应用RT-PCR和重叠延伸PCR技术，得到点突变的人IκBαM，定向克隆至PcDNA3.0真核表达载体。将SD大鼠随机分四组：Ⅰ假手术组：仅行大鼠开关腹手术；Ⅱ组：空白对照组(单纯行肝脏原位移植，未行任何处理)；Ⅲ组：PcDNA3.0空载体转染组(供体肝脏在移植前两天行PcDNA3.0空载体转染)；Ⅳ组：PcDNA3.0-IκBαM转染组(供体肝脏在移植前两天行PcDNA3.0-IκBαM转染)；术后2h，12h，24h，3d各时点分别处死各组大鼠取材。取外周血全自动生化分析仪检测肝脏酶学(ALT)；对肝脏标本进行光镜观察；利用肝组织免疫组织化学、WesternBlot和RT-PCR检测组织内NF-κBp65、TNF-α、ICAM-1在各时点蛋白和mRNA的表达水平；ELISA测定大鼠血清中TNFα的含量。 3.统计学方法：所有资料以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS10.0统计软件，各时间点组间比较采用独立T检验和单因素方差分析，P＜0.05为差异具有显著性意义。 结果： 1.大鼠肝移植手术存活率达93.3％，一周存活率81.7％。 2.肝脏组织病理显示移植组肝小叶肝窦明显充血肿胀，小叶内可见明显肝细胞气球样变性；免疫组化显示移植组NF-κB激活细胞明显多于假手术组 3.经酶切和DNA序列测定鉴定，证实重组质粒PcDNA3.0-IκBαM构建正确。 4.与PcDNA3.0-IκBαM转染组相比较，空白对照组和PcDNA3.0空载体转染组肝脏酶学指标升高具有明显差异，术后12小时为最为显著；血清TNF-α含量于移植后2h，12h具有明显差异，以2h最为显著；免疫组织化学，Western-blot和NF-PCR在不同水平检测上均提示NF-κB、TNF-α和ICAM-1在PcDNA3.0-IκBαM转染组表达明显少于空白对照组和PcDNA3.0空载体转染组，具有统计学差异。空白对照组和PcDNA3.0空载体转染组之间无统计学差异。假手术组与移植各组之间具有统计学差异。 结论： 1.缩短无肝期、预防围手术期并发症的发生是术后存活的关键。肝移植缺血再灌注早期即有NF-κB的激活。 2.真核表达载体PcDNA3.0-IκBαM构建成功。 3.IκBαM通过抑制NF-κBp65的核移位抑制其激活及间接抑制其下游基因的表达，减轻大鼠肝移植缺血再灌注损伤。

目录

前言

第一部分 大鼠肝移植模型的建立及缺血再灌注损伤中NF-κB的激活的研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分 人突变型IκBα真核表达质料的构建和鉴定

摘要

前言

实验材料和设备

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第三部分 人IκBαM在大鼠肝移植缺血再灌注损伤中的作用

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

研究小结

细胞因子在肝脏缺血再灌注损伤中的作用

附录一：攻读博士学位期间发表的论文

附录二：英文缩写词及中文对照

致谢