遗传性长QT综合征HERG基因突变体表达载体的构建及功能检测

摘要

第一部分遗传性长QT综合征HERG基因E505D突变体卵母细胞异源表达载体的构建及其功能检测 目的:构建遗传性长QT综合征HERG基因E505D突变体的卵母细胞异源表达载体，利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统进行电生理学研究，探讨一遗传性长QT综合征家系患者携带的E505DHERG基因突变引起LQTS的机制。 方法:利用快速PCR定点突变技术，设计一对引物(包含预定的突变E505D)，通过PCR，扩增出含突变位点的质粒，然后转化到超级感受态细胞中，用碱裂解法抽提质粒，进行测序鉴定，得到HERG基因E505D突变体的卵母细胞异源表达载体；将野生型和突变型的HERG基因的卵母细胞异源表达载体线性化，然后在体外转录成cRNA，通过显微注射注入爪蟾卵母细胞，然后利用双电极电压钳技术记录膜电流。 结果:在卵母细胞异源表达载体pGH19-HERG基础上获得了E505D突变体的卵母细胞异源表达载体。E505DHERG不能检测到电流的表达。突变型E505DHERG和野生型HERG共表达检测到的峰电流的幅度比野生型HERG表达检测到的峰电流的幅度小，二者差异具有显著性(p＜0.05)。突变型E505DHERG和野生型HERG共表达检测到的尾电流的幅度比野生型HERG表达检测到的尾电流的幅度小，二者差异具有显著性(p＜0.05)。突变型E505DHERG和野生型HERG共表达检测到的电流的G-V曲线与野生型HERG表达检测到的电流相比发生右移，二者V1/2有显著性差异(p＜0.05)。突变型E505DHERG和野生型HERG共表达组内向整流程度显著低于野生型HERG组(p＜0.05)。突变型E505DHERG和野生型HERG共表达组稳态激活显著低于野生型HERG组(p＜0.05)。突变型E505DHERG和野生型HERG共表达组内向整流斜率显著低于野生型HERG组(p＜0.05)。 降低电流幅度和减少通道开放，使Ikr电流减弱，动作电位时程延长，导致LQTS。 第二部分遗传性长QT综合征HERG基因真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 目的:构建HERG基因的真核表达载体，并在人胚胎肾细胞(HEK293)中进行表达。 方法:先将pGH19-HERG通过限制性酶切得到HERGcDNA，将后者克隆至pEGFP-C1中，构建表达载体pEGFP-HERG；然后将pEGFP-HERG和pIRES2-EGFP分别用BamHⅠ和XbaⅠ进行双酶切，把HERGcDNA定向克隆到pIRES2-EGFP中，即构建了HERG基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-HERG。然后利用电穿孔法将pIRES2-EGFP-HERG转染HEK293细胞。 结果:在卵母细胞异源表达载体pGH19-HERG基础上，获得了真核表达载体pIRES2-EGFP-HERG，并在HEK293细胞中成功进行了表达。 结论:我们在HERG基因卵母细胞异源表达载体的基础上，首先构建了HERG基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-HERG，利用电穿孔法将其转染至HEK293细胞中并成功地进行了表达，为下一步进行膜片钳的研究奠定基础。 第三部分遗传性长QT综合征HERG基因E505D突变体真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 目的:构建遗传性长QT综合征HERG基因E505D突变体的真核表达载体，并在HEK293细胞中进行表达。 方法:在HERG基因真核表达载体pIRES2-EGFP-HERG和包含E505D突变点的卵母细胞异源表达载体pGH19-HERG(E505D)质粒基础上，利用基因重组技术，将含有突变点的HERGcDNA基因片段克隆到pIRES2-EGFP-HERG中，并进行测序鉴定；构建了HERG基因E505D突变体的真核表达载体pIRES2-EGFP-HERG(E505D)，利用电穿孔法将其转染至HEK293细胞，48h后将细胞置荧光显微镜下观察拍照。 结果:在野生型HERG基因真核表达载体pIRES2-EGFP-HERG基础上获得了E505D突变体的真核表达载体pIRES2-EGFP-HERG(E505D)，并在HEK293细胞中成功地得到了表达。 结论:我们在HERG基因及E505D突变体的卵母细胞异源表达载体基础上，利用基因重组技术成功地构建了HERG基因E505D突变体的真核表达载体，为进一步阐明该突变点导致LQTS的发病机制奠定了基础。

目录

前言

第一部分遗传性长QT综合征HERG基因E505D突变体卵母细胞异源表达载体的构建及其功能检测

材料

方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分先天性长QT综合征HERG基因真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

材料

方法

结果

小结

参考文献

第三部分先天性长QT综合征HERG基因E505D突变体真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

材料

方法

结果

讨论

小结

参考文献

HERG通道的药理学意义

非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳记录和外源性基因的表达

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