RNA干扰沉默缺氧诱导因子HIF-1α基因治疗骨肉瘤的实验研究

摘要

一.HIF-1α在骨肉瘤中的表达及意义 目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在骨肉瘤中的表达及临床意义。 方法:采用免疫组织化学方法(SP法)，检测了48例骨肉瘤和10例正常骨组织中HIF-1α和VEGF的表达，分析两种基因表达的相关性，并对有关临床和病理指标综合分析。 结果:HIF-1α在骨肉瘤中表达阳性率为43.8％，而正常骨组织中均为阴性表达；HIF-1α和VEGF基因表达之间显著正相关(x2=4.769,P=0.029)；HIF-1α的表达与年龄、性别、肿瘤的体积大小、Dahlin分型无关(P＞.05)，而与骨肉瘤临床分期、软组织浸润以及Price分级密切相关(P＜0.05)。 结论：HIF-1α的高表达参与了骨肉瘤的恶性进展，可能通过刺激VEGF表达促进缺氧环境下骨肉瘤的血管新生，可作为新的分子靶点应用于骨肉瘤诊断、基因治疗和预后判断。 二.缺氧对骨肉瘤SaOS-2细胞生物学特性的影响 目的:观察体外缺氧条件下骨肉瘤SaOS-2生物学特性的改变。 方法:建立骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型。流式细胞仪分析细胞周期改变。划痕损伤法和Boyden侵袭小室检测细胞体外侵袭迁移能力的变化。观察缺氧培养不同时相(8h，16h，24h)HIF-1α和VEGF的表达。半定量RT-PCR方法检测HIF-1α和VEGFmRNA的转录水平，免疫组化(SP法)检测骨肉瘤细胞中HIF-1α和VEGF蛋白表达情况，BLISA法检测培养上清中VEGF蛋白表达。 结果:缺氧培养16h内，细胞周期表现为G1期阻滞。24小时后，细胞周期恢复常氧状态。缺氧培养24h后，骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭能力明显增强。缺氧处理后，HIF-1αmRNA转录水平没有明显改变，蛋白表达升高。VEGFmRNA以及蛋白的表达在缺氧条件下均显著增强。 结论:骨肉瘤细胞存在缺氧耐受机制，通过一系列生物学特性的改变来应对缺氧带来的不利。 三.HIF-1α短发夹状小RNA干扰载体的构建及鉴定 目的:构建低氧诱导因子HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体，观察发夹状双链小干涉RNA对骨肉瘤细胞HIF-1α的转录后的基因沉默效果。 方法:体外合成两对互补的寡核苷酸链，分别针对缺氧诱导因子HIF-1αmRNA序列的两个靶位点。退火形成双链，插入pSilencerTMneoU62.1真核表达载体。将构建好的载体经脂质体介导转染骨肉瘤SaOS-2细胞，观察HIF-1α基因的沉默效果。半定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA的抑制程度，免疫荧光和免疫印迹(WesternBlot)检测HIF-1α蛋白表达情况。 结果:测序证实成功构建HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体。转录生成的发夹状小干涉能够特异抑制HIF-1α表达。RT-PCR结果显示针对HIF-1αmRNA序列的两个靶位点的沉默效果分别为69％和92％，免疫荧光显示转染后荧光强度显著降低，免疫印迹显示两个靶位点的发夹状小干涉RNA分被使HIF-1α蛋白表达下降66％和90％。 结论:通过体内转录生成的发夹状小干涉RNA能够使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默。 四.靶向HIF-1α的siRNA治疗骨肉瘤的体内外实验研究 目的:观察靶向缺氧诱导因子HIF-1α的短发夹状小干扰RNA基因转染对骨肉瘤生长的影响。 方法:针对HIF-1α构建短发夹状小干扰RNA真核表达载体并转染骨肉瘤细胞系SaOS-2。骨肉瘤细胞置于缺氧诱导培养基中培养。MTT比色分析检测细胞体外增殖活力，DNA凝胶电泳、透射电镜、原位末端标记TUNEL法、AnnexinV/PI双标记法检测细胞的凋亡。同时，建立裸鼠移植瘤模型，通过常规HE染色、HIF-1α、CD34免疫组化观察HIF-1α基因沉默后对骨肉瘤体内治疗效果。 结果:靶向缺氧诱导因子HIF-1α的短发夹状小干扰RNA能够显著降低骨肉瘤细胞的增殖活性和诱导细胞凋亡。裸鼠移植瘤实验显示转染组肿瘤生长减慢，肿瘤组织中可见大量坏死组织。瘤组织HIF-1α蛋白表达降低，微血管密度显著低于对照组。 结论:靶向HIF-1α基因的短发夹状小干扰RNA可以有效阻断骨肉瘤缺氧耐受转导通路，抑制骨肉瘤细胞的生长。

目录

缩写词表

前言

第一部分HIF-1α在骨肉瘤中的表达及意义

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分缺氧对骨肉瘤SaOS-2细胞的生物学特性的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第三部分HIF-1α短发夹状小RNA干扰载体的构建及鉴定

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

第四部分RNA干扰沉默缺氧诱导因子HIF-1α基因治疗骨肉瘤的体内外实验研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

小结

缺氧诱导因子HIF-1的研究进展

在校期间发表的论文

致谢