RNA干扰沉默宫颈癌缺氧诱导因子HIF-1α基因的相关研究

摘要

背景与研究目的 实体肿瘤的高速生长必然会导致肿瘤内部血液供应的相对不足和氧张力的降低，当肿瘤体积大于1mm<'3>时自身血供就不能满足肿瘤细胞生长的需要，开始出现缺氧区域。氧分压的降低使HIF-l α的羟基被抑制从而被激活，HIF-1α进一步与靶基因的HRE中的增强子结合，对缺氧作出复杂的应激反应，诱导肿瘤新血管形成和提高糖酵解数率。Zhong等研究发现大部分恶性肿瘤中有HIF-1α的表达，良性肿瘤和正常组织却无HIF-1 α表达，目前有关HIF-l α与妇科恶性肿瘤生长和发展的的相关基础研究报道不多，宫颈癌细胞缺氧条件下血管生成激活机制的研究也尚未见报道，为进行阻断肿瘤缺氧耐受机制的妇科肿瘤基因治疗建立研究平台，本研究拟检测包括宫颈癌细胞在内的多种妇科恶性肿瘤细胞中HIF-1α的蛋白表达及其与缺氧时间和缺氧浓度的相关性；并将针对HIF-1 α的短发夹状小干扰RNA(small hairpin RNA，shRNA)首次转染入宫颈癌HeLa细胞内，在mRNA和蛋白水平检测是否沉默了细胞中HIF-1 α基因的表达；HIF-l α表达抑制后对VEGF是如何调控的；宫颈癌细胞的凋亡途径是否受到激活；具体探讨它对体外HeLa细胞株的增殖和凋亡作用。力求为今后进行针对HIF-1 α的妇科肿瘤的基因治疗探寻一条新的可行途径。 方法 1、应用Western blot检测HeLa，Siha，Caski，OVCAR8，SKOV3,PA-1等10种妇科恶性肿瘤细胞在常氧和缺氧培养24小时后HIF-1α蛋白表达情况。检测缺氧培养不同时段和不同缺氧程度时HIF-1α蛋白的表达变化和相关性。了解HIF-1α在缺氧条件下不同细胞株表现的不同特性。 2、将含针对HIF-1α的shRNA有效序列表达载体和无效干扰序列的表达载体分别转染宫颈癌Hela细胞株，经G41S筛选得到阳性克隆细胞pSUPER-HIF-1α(有效序列，Si组)和pSUPER-NS(干扰序列，NS组)，再与HeLa细胞一起分别置于常氧和缺氧箱中培养24小时。用荧光定量PCR、Western blot法或ELISA双抗体夹心法分别检测pSUPER-HIF-1 α转染组和无效干扰序列组和未转染缺氧培养对照组的HIF-1a和VEGF的mRNA及蛋白的表达情况，了解HIF-1a基因的沉默效果。 3、用MTT比色法分析检测三组细胞缺氧培养下的增殖活性，Hoechst染色法检测细胞的凋亡情况。流式细胞仪进行细胞凋亡率和周期分布情况检测。了解沉默HIF-1α基因后是否激活细胞的凋亡途径和影响它的增殖活性，是否达到抑瘤的效果。 结果 1、Western blot检测结果显示10种妇科恶性肿瘤细胞在缺氧培养后都有HIF-1a蛋白明显的增高表达；HeLa细胞中HIF-1 a的蛋白表达与缺氧浓度有关；与缺氧时间无明显相关。不同的细胞缺氧后出现表达高峰不一致。 2、转染pSUPER-HIF-1a(有效序列组)和pSUPER-NS(无效序列组)到肿瘤细胞后，缺氧24 h，实时荧光定量RT-PCR检测结果显示，细胞内HIF-1a mRNA和VEGFmRNA的表达被抑制，差异显著(p<0.05)，两者缺氧24小时mRNA抑制率分别为81.65％和67.78％。和pSUPER-NS(无效序列组)和对照组相比蛋白表达也明显下调，缺氧72小时时HIF-1a和VEGF蛋白的表达被抑制率为74.43％和 66.18％。证实转染入细胞内的pSUPER—HIF-1 α有效地沉默了HIF-1 α基因，HIF-1 α对VEGF在转录和翻译水平都有调控作用。 3、与对照组比较，Hela细胞的HIF-1 α转染组在缺氧状态下增殖活性降低，明显低于干扰序列转染组和未转染组；Hoechst法荧光显微镜观察结果显示，缺氧72小时后，pSUPER—HIF-1 α(有效序列组)细胞中可见较多凋亡小体；流式细胞术检测显示，厌氧72 h时细胞凋亡率最高，达23.5％，明显高于对照组(p<0.05)；细胞周期分析显示G1期细胞比例明显增多，S期细胞比例明显降低；有氧培养下各组检测值无显著差别，转染无效序列组和对照组之间无统计学差异。pSUPER—HIF-1 α转染入细胞后可促进细胞的凋亡和阻抑细胞的增殖活性。 结论 与大多数实体肿瘤细胞一样，妇科肿瘤细胞中也存在缺氧耐受的分子机制。在宫颈癌HeLa细胞中，HIF-1 α在VEGF的低氧诱导途径中充当着决定性的调控作用。HIF-1 α shRNA表达载体能特异、高效地抑制宫颈癌Hela细胞HIF-1 α基因的表达，作用时间至可维持至抗性克隆形成后4周。特异性针对HIF-1 α的小干扰可调控肿瘤细胞周期，抑制宫颈癌细胞的恶性增殖，促进细胞凋亡。

目录

声明

前言

第一部分：妇科恶性肿瘤细胞低氧条件下缺氧诱导因子表达变化的实验研究

第二部分RNAi使宫颈癌HeLa细胞中HIF-1α基因沉默的实验研究

第三部分针对HIF-1α的shRNA表达载体对宫颈癌HeLa细胞增殖凋亡和细胞周期的影响

全文小结

参考文献

综述 HIF-1α在妇科恶性肿瘤中的研究进展

致谢