以转基因为基础的胰岛生物发光影像学和胰岛素合成功能研究

摘要

临床胰岛移植最近几年的突破性进展，为糖尿病的治愈带来了希望，其相关的临床和基础研究也进展较快，其中利用转基因技术对胰岛功能进行改造，从而促进胰岛移植的临床应用是一个重要方向。本论文即针对以转基因技术为基础的胰岛生物发光显像技术(BLI)，和胰岛被转入外源性胰岛素基因后的合成功能特性，作了一定程度的探讨。BLI可实现对植入胰岛的在体监测，为临床治疗和相关研究提供及时、直接、准确的信息。而将外源性胰岛素基因转入胰岛细胞，可提高其胰岛素合成释放功能，用更少量的胰岛即可达到治疗目的，从而节约供体，在一定程度上缓解供体紧缺的矛盾。此两项技术均可能对促进胰岛移植的广泛临床应用起重要作用。
　　 第一部分、生物发光显像技术对胰岛移植后植入胰岛监测作用研究
　　 目的：目前的临床胰岛移植对植入受体后的胰岛缺乏安全有效的监测手段，是一个亟待解决的重要问题，本研究通过小鼠动物实验，探讨用BLI监测植入胰岛存活状态的优势，并针对该方法临床应用的主要障碍——光信号因经过厚层组织而发生衰减，无法成像——提出可行的解决方法，即用移植于皮下脂肪内的生物发光胰岛，作为深部器官内植入胰岛的标志，从而证明将BLI用于临床的可行性。
　　 方法：自脑死亡器官捐献者胰腺、及正常B6小鼠、Bclb/c小鼠胰腺分离胰岛，将荧光素酶基因转入胰岛(生物发光胰岛)，并制作小鼠糖尿病模型，将生物发光胰岛植入糖尿病小鼠，分别制作皮下脂肪内胰岛移植模型和皮下及肾包膜下同时移植模型。通过选择不同供受体搭配，将模型分为无免疫排斥组和有免疫排斥组。对皮下移植模型，在各设计时间点用生物发光显像装置对受体小鼠进行扫描成像，并测定光密度值，观察无排斥组在不同数量生物发光胰岛移植后，胰岛植入区域的光密度强弱，探讨光密度与植入胰岛数量的相关性；观察有排斥组胰岛植入区域光密度随时间变化的规律，并同期监测受体小鼠随机血糖，比较光密度和随机血糖变化时间。对皮下及肾包膜下同时移植模型，在移植后60d取无排斥组植入胰岛的皮下脂肪和肾脏标本，在移植后7d和10d取有排斥组相同标本，常规组织切片进行HE染色和AF染色，观察组织内植入胰岛的形态、胰岛B细胞功能和胰岛区域炎性反应程度，并将组织学变化时间与光密度及血糖变化时间(皮下移植模型有排斥组)进行对比。
　　 结果：在皮下移植模型中，无排斥组胰岛植入区光密度值与植入胰岛数量呈正相关，有排斥组植入区光密度值在移植后早期升高，随后下降，而随机血糖则先降低后升高，光密度开始下降的时间早于随机血糖开始升高的时间，二者差异具统计学意义。在皮下及肾包膜下同时移植模型中，无排斥组移植后60d不同移植部位的胰岛均形态完整，无炎性细胞浸润，B细胞内含大量分泌颗粒；有排斥组移植后7d可见胰岛植入区域周围呈轻度炎性反应，B细胞内分泌颗粒减少，移植后10d可见植入区域重度炎性反应，胰岛形态破坏及B细胞内分泌颗粒减少。在相同时间点，两个移植部位的组织学变化程度均相同，移植于皮下脂肪内的生物发光胰岛，可以作为深部器官内植入胰岛生存状态的标志。组织学变化时间与光密度和随机血糖变化时间(皮下移植模型有排斥组)相符。
　　 结论：通过转基因技术实现的胰岛BLI，可在活体受体及时、直观、准确的监测植入胰岛存活状态，并可用移植于皮下脂肪内的生物发光胰岛，作为深部器官内植入胰岛的标志，解决BLI应用于临床的障碍。BLI是临床胰岛移植术后监测的良好选择，也为相关研究提供了重要工具。
　　 第二部分、转入胰岛素基因胰岛的胰岛素合成功能研究
　　 目的：已有研究证明，转入外源性胰岛素基因的人类胰岛，在受高浓度葡萄糖刺激时，可比正常胰岛分泌更多的胰岛素，在胰岛移植模型中，此种转基因胰岛具备更高的逆转糖尿病受体高血糖的能力。本研究通过转基因技术制作具有双胰岛素系统的胰岛模型，并模拟移植后体内损伤因素，从细胞内胰岛素含量的角度，探讨转入胰岛素基因胰岛的合成功能特性，并探讨当损伤因素存在时，其胰岛素合成功能是否比正常胰岛具有更强的抵抗力，从而进一步揭示此种转基因胰岛的生物学特性。
　　 方法：自正常C57/B6(B6)小鼠胰腺分离胰岛，将人类前胰岛素基因转入这些胰岛并表达，制作可表达内源性和外源性两种胰岛素的双胰岛素模型，并在体外随机分组进行正常培养或加入促炎细胞因子培养，在设计时间点取胰岛样品，经超声裂解后分别测定细胞内不同种类胰岛素含量，观察它们在不同培养条件下的变化的规律，并计算各时间点胞内胰岛素总含量，与正常胰岛进行对比。
　　 结果：在正常培养中，正常小鼠胰岛与转基因小鼠胰岛细胞内胰岛素总含量，在培养过程中无统计学差异，并在9d内保持稳定，而转基因胰岛细胞内人类胰岛素含量则随时间逐渐增高；在加入促炎细胞因子的培养中，正常小鼠胰岛与转基因小鼠胰岛细胞内胰岛素总含量，均自加入细胞因子后第5d至6d开始逐渐下降，但在相同时间点无统计学差异，转基因小鼠胰岛细胞内人类胰岛素含量亦有相同变化规律。
　　 结论：以往研究所证明的，转入外源性胰岛素基因胰岛比正常胰岛具有更高的逆转高血糖能力，并非由于其细胞内含有更多的胰岛素，而是因为在高糖刺激时，能够合成释放更多的胰岛素。转基因胰岛的胰岛素合成功能对细胞因子不具有更强的抵抗力，而是与正常胰岛具有相同变化规律。转基因胰岛的研究可能为临床胰岛移植提供节约供体的重要途径。