稳定表达TNF-α及其突变体基因的人源细胞模型的建立

摘要

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是一种重要的炎症因子，主要由激活的单核/巨噬细胞产生。TNF-α在机体的免疫应答与炎症反应中起着重要作用，控制着细胞分化、增殖与凋亡。它以两种形式存在：26kDa的膜型TNF-α（mTNF-α）与17kDa的可溶型TNF-α（sTNF-α），sTNF-α由mTNF-α酶解而来。两型TNF-α通过与两型受体（TNFR1与TNFR2）结合而发挥广泛的生物学作用，但两型TNF-α的胞毒作用方式和机制不尽相同。此外，mTNF-α除了作为配体与TNFR结合后向靶细胞传递正向信号而发挥生物学效应外，还可同时作为受体向效应细胞传递反向信号（reverse signaling）。
　　 本室前期工作已经建立了能分泌含三种TNF-α基因（野生型TNF-α、膜型TNF-α突变体和分泌型TNF-α突变体）的重组逆转录病毒的包装细胞。本研究首先培养这三株包装细胞，分别收集高滴度逆转录病毒，感染自身TNF-α表达量极低的人骨肉瘤细胞系（MG63），用G418筛选两轮得到稳定表达wTNF-α、mTNF-α和sTNF-α蛋白的细胞模型，为进一步研究两型TNF-α的生物学功能以及信号转导通路等提供实验工具。
　　 一、鉴定MG63细胞TNF-α的表达
　　 同等条件下分别提取MG63细胞和HL-60细胞的总mRNA进行RT-PCR检测，经过35个循环后，取相同量的产物进行电泳，结果证实：MG63细胞中TNF-αmRNA水平极低，明显低于HL-60细胞。同时，在相同条件下分别提取MG63细胞和HL-60细胞的总蛋白进行Western blotting检测，结果显示HL-60细胞可见明显的TNF-α条带，MG63细胞仅出现一条微弱的条带，而两者的β-actin蛋白量一致，提示MG63细胞的TNF-α表达量很低。此外，流式细胞术检测结果显示：MG63细胞的TNF-α表达量为0.53%；ELISA检测其培养上清中表达的sTNF-α低于检测水平。
　　 二、稳定表达TNF-α及其突变体细胞模型的建立
　　 复苏本室前期工作建立的表达TNF-α及其突变体基因的重组逆转录病毒的包装细胞克隆，收集高滴度逆转录病毒，感染MG63细胞，经过筛选建立了表达TNF-α及其突变体基因的三种细胞模型。用各种方法鉴定证实TNF-α及其突变体基因在MG63细胞中得到有效表达。FCM结果显示：MG63/wTNF细胞表达TNF-α量达29.97%；MG63/mTNF细胞表达TNF-α的量高达70.84%；然而MG63/sTNF细胞表面也有少量的TNF-α的表达（9.15%），可能是由于细胞表面的TNFR结合了部分培养上清中的sTNF-α所致。ELISA检测证实MG63/wTNF细胞和MG63/sTNF细胞的培养上清中sTNF-α的含量很高，分别为437.16pg/ml、380.95pg/ml；而MG63/mTNF细胞的培养上清中sTNF-α的表达量低于检测水平。免疫荧光结果显示MG63/sTNF细胞表面有微弱的荧光，呈环状分布；而MG63/wTNF细胞和MG63/mTNF细胞可见有很强的绿色荧光。Western blotting检测的结果表明：MG63/wTNF细胞可见有26kD的mTNF-α和17kD的sTNF-α，但sTNF-α的量远远低于mTNF-α，仅见微弱的条带；MG63/mTNF细胞仅见明显的26kD的mTNF-α的表达；MG63/sTNF细胞仅见微弱的26kD mTNF-α，但其培养上清中可见有明显的17kD sTNF-α的表达。上述结果均提示这三种细胞模型建立成功。
　　 三、TNF-α及其突变体的生物活性
　　 采用TNF-α敏感细胞株L929鉴定TNF-α及其突变体的生物学活性。将三种细胞株培养至对数生长期，取相同细胞数培养24～48h，收集培养细胞和上清分别与靶细胞细胞共孵育，进行TNF-α胞毒活性的检测。结果显示：固定的MG63/mTNF细胞具有胞毒活性（64.28%）；MG63/sTNF细胞的培养上清亦具有胞毒活性（30.65%）；MG63/wTNF细胞的固定细胞和培养上清均有胞毒活性（37.79%、38.02%）。此外，细胞的胞毒效应与其TNF-α的表达量呈正相关，并且胞毒效应均能被TNF-α单抗所阻断（p<0.01），提示其胞毒活性为TNF-α特异性的。
　　 四、细胞表达TNF-α基因的持久性检测
　　 本研究的目的是建立稳定表达目的基因的细胞模型，故为了观察细胞表达目的基因的持久性，采用了FCM定期测定连续培养的细胞模型TNF-α表达量的改变。检测结果显示：在G418维持培养下，细胞株经过6次传代培养约4周左右，TNF-α的表达量从86.23%下降至50%左右；而无G418维持培养的细胞株，经过约5次传代培养约2.5周左右，TNF-α的表达量下降至50%。
　　 此外，由于细胞克隆在长时间传代培养后，目的基因的表达率明显下降。为了维持较高表达目的基因的细胞克隆，将复苏的细胞克隆（FCM检测其TNF-α的表达率为21.29%）再次进行亚克隆筛选，从而获得了目的基因表达较高的亚克隆，FCM检测其mTNF-α的表达率达到87.08%。
　　 结论：成功建立稳定表达野生型、跨膜型和分泌型TNF-α基因的人源细胞模型。三种细胞模型表达的TNF-α及其突变体基因均具有生物学活性。