内源性哇巴因在妊娠期高血压疾病发病机理中的作用研究

摘要

第一部分、抗哇巴因多克隆抗体的制备。 目的：制备抗哇巴因多克隆抗体。 方法：选择6只4～5月龄、体重为2～2.5公斤雄性健康日本大耳白兔，采用过碘酸钠氧化法偶联Ouabain和OVA/BSA合成Ouabain-OVA和Ouabain-BSA完全抗原。利用Ouabain-BSA完全抗原免疫日本大耳白兔制备哇巴因抗血清；采用饱和硫酸铵沉淀法联合DEAE-D52阴离子纤维素离子交换层析法纯化哇巴因多克隆抗体，经SDS-PAGE法检测抗体纯度，ELISA法检测抗体效价、分装或冷冻干燥-20℃保存备用。 结果：过碘酸钠氧化法偶联合成的Ouabain-OVA和Ouabain-BSA完全抗原的偶联率分别为1:14和1:18；Ouabain-BSA完全抗原免疫日本大耳白兔获得的Ouabain抗血清经纯化后得到Ouabain多克隆抗体，其纯度高，效价为1:500。 结论：过碘酸钠氧化法合成的Ouabain-BSA完全抗原能有效免疫日本大耳白兔获得Ouabain抗血清；序贯采用饱和硫酸铵沉淀法和DEAE-D52阴离子纤维素离子交换层析法纯化Ouabain抗血清能获得高纯度、高效价的Ouabain多克隆抗体。 第二部分、内源性哇巴因与妊娠期高血压疾病的相关性研究。 目的: 通过观察内源性哇巴因（EO）在不同病程妊娠期高血压疾病（HDCP）患者胎盘组织中的表达以及在孕妇外周血和新生儿脐血中的水平变化，证实EO在胎盘组织中的表达及其在血清中的水平与HDCP发生发展的相关性，并初步探讨胎儿-胎盘分泌EO的可能性。 方法：选择30例正常晚期妊娠妇女为对照组，30例HDCP患者为病例组；病例组分为妊娠期高血压组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组，每组10例。采用免疫组织化学S-P法、免疫荧光组织化学染色法（IFH）观察EO在胎盘组织的表达；采用竞争性ELISA法检测孕妇外周血和新生儿脐血中EO的水平。 结果： ①病例组各组EO在胎盘组织的表达明显高于对照组（P<0.01），且随着病程的加重，EO的表达逐渐增强（P<0.01）。 ②病例组孕妇外周血/新生儿脐血的EO水平显著高于对照组，并且随着疾病的发展，EO的含量逐渐增加（P<0.01）。 ③新生儿脐血EO水平均显著高于产前孕妇外周血（P<0.01），且孕妇外周血EO水平在产后第三天明显降低（P<0.01）。 结论：EO在HDCP患者胎盘组织中的表达明显增强，且其表达强度与病程的发展呈明显的正相关；孕妇外周血及新生儿脐血中EO水平显著升高，与病程的发展亦呈明显的正相关，产后3天孕妇外周血中EO水平明显下降。提示：EO直接参与了妊娠高血压疾病的病理调控。 此外，本研究还显示，各组新生儿脐血中EO水平均明显高于孕妇外周血EO水平，提示：胎儿-胎盘单位可能分泌EO，加剧孕妇外周血EO水平的升高，共同参与妊娠高血压疾病的病理调控过程。 第三部分、内源性哇巴因在妊娠高血压疾病发生发展中的病理调控机制研究。 目的: 探讨EO在HDCP中的病理调控机制。 方法：选择30例正常晚期妊娠妇女为对照组，30例妊娠高血压疾病患者为病例组；病例组分为妊娠期高血压组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组，各组10例。采用S-P法、免疫荧光组织化学染色法（IFH）观察EO受体Na+/K+ATPase-α1 subunit(NKA-α1) 在胎盘组织中的表达，同时采用定磷法检测孕妇外周血红细胞Na+/K+ATPase(NKA)的活性；硝酸还原酶法、ELISA法分别检测孕妇外周血和新生儿脐血中NO和ET-1的水平。 结果： ①病例组各组EO的受体NKA-α1在胎盘组织的表达显著低于对照组，且随着疾病的发展，表达强度逐渐减弱（P<0.01）。 ②病例组各组孕妇外周血红细胞膜NKA活性显著低于对照组，且随着疾病的加重，其活性逐渐减弱（P<0.01）。 ③病例组孕妇外周血/新生儿脐血的ET-1水平显著高于对照组（P<0.01）；而NO水平明显低于对照组（P<0.01）。此外，病例组和对照组的脐血ET-1水平均显著高于孕妇外周血（P<0.01），而NO水平则明显低于孕妇外周血（P<0.01）。 ④结合前期实验结果，EO的表达强度、孕妇外周血血清EO的水平均与NKA-α1的表达强度、孕妇外周血红细胞膜NKA活性呈负相关（P<0.01）；本研究同时还证实EO表达强度、孕妇外周血血清EO的水平均与ET-1呈正相关（P<0.01），与NO呈负相关（P<0.01）。 结论：EO的受体NKA的活性及其α1亚基在妊娠高血压疾病患者胎盘组织中的表达随着疾病的加重而降低，且EO的表达及血清EO水平与ET-1/NO的失衡有显著的相关性，提示：EO一方面可能通过抑制NKA-α1的表达以及NKA的活性参与妊娠高血压疾病的发生发展，另一方面则通过影响血管内膜ET-1/NO的分泌表达导致或进一步加剧血管内膜ET-1/NO的失衡参与妊娠高血压疾病的病理调控。