细胞因子和化合物构成的组方，其促进神经再生作用及在神经系统疾患研究和诊治中的作用

摘要

本发明涉及一种细胞因子和化合物构成的组方及其促进神经再生作用和在神经系统疾患研究和诊治中的作用，本发明含有胰岛素、牛血清白蛋白、腐胺、氢化可的松、孕酮、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸、亚硒酸钠、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子等，还可以含有脑源性神经营养因子和神经生长因子。本发明药物组合物可以促进神经元的分裂以及神经再生，本发明主要用于治疗神经系统的疾病，如脊髓损伤造成的截瘫，缺氧损伤造成的脑瘫，治疗神经系统退行变如巴金森氏病，老年痴呆等疾患。

说明书

技术领域：

本发明属于神经系统疾患领域，具体地说是利用细胞因子之间，细胞因子与化合物间的协同作用，构建能促进神经元分裂和具有强大神经再生作用的细胞因子和化合物的组方，以及组方在神经系统疾患研究、诊断和治疗中的应用。

背景技术

神经再生困难，关键是神经元不能分裂。神经元是否能够分裂是生命科学领域里的重大问题。长期以来，神经元被认为是终末分化的细胞(Raedler，E.etal(1978).Anat.Embryol.154，267-312.；McConnell，S.K.(1988).BrainRes.Rev.1，：1-23.；McKay，R.D.G.(1989).Cell58，815-821.；Pincus，D.W.et al.(1988).Neurosurgery，42(4)，858-868)。一般神经元在动物出生后不久就脱离了细胞周期，丧失了分裂增殖的能力(Jessel，T.M.(1991).Reactions of neurons to in jury.In Kandel E.R.，Schwartz J.，and JessellT.M.(eds)Principles of neural science(3^rdedition)，Appleton and Lange，pp.259-269)。因此神经元一旦损伤或者病变，就会造成永久的功能丧失。

神经系统的多种疾病，如老年痴呆、巴金森氏病等退行性变和脊髓损伤，脑缺氧损伤等，都属于比较严重的神经系统疾患，就是由于神经元死亡或者退行性变，无法修复或者替代而造成的严重并且不可治疗的疾患。近年来，很多科学家发现在动物大脑中存在神经再生现象(Altman，J.(1962).Science 135，1127-1129.；Kaplan，M.S.et al，(1977).Science 197，1092-1094.；Bayer，S.A.et al，(1982).Science 216，890-892.；Evans，J.et al，(2002).JNeurophysiol.87，1076-1085；Kaplan，MS.et al(1981).J.Comp.Neurol.195，323-338.；Huang，L.et al，(1990).Dev.Brain Res.51，123-127.)。进一步的研究还发现，这些发生在大脑中的神经再生是由于存在于大脑的神经干细胞所致(Weiss，S.等，(1996).Trends Neurosci.387-393.；Stemple，D.L.等，(1992).Cell 71，1-20；Gritti，A.等，(1996).J.Neurosci.16(3)，1091-1100；Magevi，S.S.等，(2000).Nature 405，951-955.)。神经干细胞的发现，使人认识到存在治疗中枢神经系统疾患的可能性。但是神经干细胞在临床上应用还有许多困难，首先是神经干细胞来源困难，自身的神经干细胞来源受限；其次是异体神经干细胞牵涉伦理问题；第三是神经干细胞定向分化困难。由于大脑结构的特异性，根据其神经介质，神经元有数百种之多。要定向诱导神经干细胞分化成为数百种神经细胞，其难度可想而知；第四是植入的神经干细胞难以与宿主细胞形成正确的突触联系。神经元还要接受无数其他神经元来的信息，并通过轴突传递到远处发挥作用，因此即使神经干细胞能够被正确植入到特定部位，还是难以达到修复作用。因此通过植入神经干细胞治疗神经系统疾患在短期内还无法实现。

本专利发明人前期研究发现细胞因子和化合物构成的组方能够明确促进原代神经元分裂，并且多种技术证明分裂的神经元具有成熟神经元的结构和功能特征。神经元分裂现象的发现也给人启发，即有可能通过诱导神经的分裂，从而达到修复神经损伤和神经系统退行性变疾患的目的。

在另外的研究中，发明人还发现基于上述组方构成的可以明确促进神经再生。其作用远远大于任何细胞因子、化合物或者组方中的单一成分促进神经再生的作用。至今没有发现有关中枢的神经元可以被诱导分裂的报道，以及利用细胞因子的协同作用构成组方治疗神经损伤的报道。

发明内容

本发明目的是提供促进神经元分裂和神经再生的细胞因子和化合物构成的组方。

本发明的另一目的是提供促进神经元分裂和神经再生的细胞因子和化合物构成的组方在制备治疗神经系统疾患的药物上的应用。

本发明的第三个目的是促进神经元分裂和神经再生的细胞因子和化合物构成的组方在制备神经系统疾患研究和诊断试剂上的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

促进神经元分裂和神经再生的细胞因子和化合物构成的组方，含有胰岛素、牛血清白蛋白、腐胺、氢化可的松、孕酮、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸、亚硒酸钠、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。

上述细胞因子和化合物构成的组方，其组成成分及其重量百分比(％)为：

胰岛素                 0.04～0.4

转铁蛋白               0.8～8

牛血清白蛋白           0.04～0.4

腐胺                   0.12～1.2

氢化可的松             3.5×10^-5～3.5×10^-4

孕酮                   5×10^-5～5×10^-4

亚硒酸纳               4×10^-5～4×10^-4

三碘甲状腺原氨酸       8×10^-3～8×10^-2

表皮生长因子           8×10^-5～8×10^-4

碱性成纤维细胞生长因子 8×10^-5～8×10^-4

其余为水

上述细胞因子和化合物构成的组方，还含有脑源性神经营养因子和神经生长因子。

上述细胞因子和化合物构成的组方，其组成成分及其重量百分比(％)为：

胰岛素                 0.04～0.4

转铁蛋白               0.8～8

牛血清白蛋白           0.04～0.4

腐胺                   0.12～1.2

氢化可的松             3.5×10^-5～3.5×10^-4

孕酮                   5×10^-5～5×10^-4

亚硒酸钠               4×10^-5～4×10^-4

三碘甲状腺原氨酸       8×10^-3～8×10^-2

表皮生长因子           8×10^-5～8×10^-4

碱性成纤维细胞生长因子 8×10^-5～8×10^-4

脑源性神经营养因子     1×10^-4～1×10^-3

神经生长因子           2×10^-4～2×10^-3

其余为水。

上述细胞因子和化合物构成的组方中所述的水通常为双蒸水。

上述细胞因子和化合物构成的组方在制备治疗神经系统疾患的药物和研究、诊断试剂中的应用。

上述细胞因子和化合物构成的组方在制备治疗神经损伤和神经系统退行并病变的药物和研究、诊断试剂中的应用。

上述细胞因子和化合物构成的组方在制备促进神经元分裂的药物和研究试剂中的应用。

上述细胞因子和化合物构成的组方在制备治疗脊髓损伤，外周神经损伤等损伤性疾患的药物和研究诊断、试剂中的应用。

上述细胞因子和化合物构成的组方在制备治疗脑缺氧、缺血所致的各种脑损伤的药物和研究、诊断试剂中的应用。

上述细胞因子和化合物构成的组方在制备治疗老年痴呆，巴金森氏病，脊髓侧索硬化，等中枢神经退行变等疾患的药物和研究、诊断试剂中的应用。

上述细胞因子和化合物构成的组方的制备方法：首先称取氢化可的松和孕酮，并分别溶于无水乙醇中，备用；称取碱性成纤维细胞生长因子溶于Tris缓冲液或者水中中(pH7.6，含0.1％BSA)，备用；按照比例称取胰岛素、牛血清白蛋白、腐胺、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸、亚硒酸钠和表皮生长因子，将它们加入到双蒸水溶解中，并将氢化可的松和孕酮的无水乙醇溶液以及碱性成纤维细胞生长因子的Tris溶液或者水溶液加入到双蒸水中，混和均匀，并加双蒸水定容至所需体积即得本发明药物混合物。

上述细胞因子和化合物构成的组方的制备方法，还可以是：首先按照比例称取氢化可的松和孕酮，并分别溶于无水乙醇中，备用；称取碱性成纤维细胞生长因子溶于Tris缓冲液中(pH7.6，含0.1％BSA)，备用；按照比例称取胰岛素、牛血清白蛋白、腐胺、转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸、亚硒酸钠、表皮生长因子、脑源性神经营养因子和神经生长因子，将它们加入到双蒸水中溶解，并将氢化可的松和孕酮的无水乙醇溶液以及碱性成纤维细胞生长因子的Tris溶液或者水溶液加入到双蒸水中，混和均匀，并加双蒸水定容至所需体积即得本发明药物混合物。

转铁蛋白(Transferrin)作为一种生长因子，是细胞分裂增殖所必需的，通过与细胞表面的转铁蛋白受体结合而发挥作用。转铁蛋白的促细胞分裂作用依赖于其运输铁离子至细胞内(Jennifer L.等，Experimental cell research，17：687-695)。铁离子是核糖核苷酸还原酶的重要组成成分，其活性与DNA合成的速率密切相关，在S期活性明显增强。

胰岛素(Insulin)促进细胞生长，通过帮助细胞获取基本的营养物质，其受体具有酪氨酸激酶的活性(Crouch，1991；Csaba，1991)

表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，简称EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，简称bFGF)都是常用的有丝分裂原，能够促进多种类型细胞的分裂增殖，分别通过与其受体EGFR、bFGFR结合发挥作用。其中bFGF具有神经营养的作用，能够促进神经损伤后轴突的延伸、发芽生长和提高神经再生的速度(J.Kungnickel，K.Haase，J.Konitzer，M.Timmer，C.Grothe，J.Neurobiol 66：940-948，2006)。EGF和FGF能够促进脊髓损伤后再生(MC.Jimenez Hamann，CH.Tator，MS.Shoichet，Exp Neurol.194：106-19，2005)。

神经营养因子是一类特殊的蛋白质，它具有特异的神经营养活性作用。实验证实，神经营养因子能阻断由神经损伤引起的立早基因(IEG’s)的表达。神经营养因子强有力的促生长作用提示在周围神经损伤中可将其用来防止或减少神经元丧失功能或死亡，促进轴突再生。所有的神经营养因子都是通过与靶细胞表面特定类别的酪氨酸激酶受体结合而发挥作用，每种受体一旦被配体受体结合物激活，将通过细胞内信号通道产生蛋白质磷酸化作用，随后激活基因。

神经生长因子(Nerve Growth Factor，简称NGF)不仅能够促进成年动物胆碱能神经元的存活，而且能够诱导中枢神经系统的损伤神经纤维在合适的基质内再生，也能促进周围神经的再生(WJ.Freed，Brain Res Bull.1：393-412(1976)；FH.Gage，G.Buzsaki，DM.Armstrong，Prog Brain Res 83：357-70(1990)；H.Horie，Y.Bando，H.Chi，T.Takenaka，Neurosci Lett 121：125-8(1991)；LF.Kromer，CJ.Cornbrooks，Ann N Y Acad Sci 495：207-24(1987).)NGF是神经系统中最重要的生物活性分子之一，影响周围及中枢神经中某些神经元的存活及分化。在周围神经损伤后，有保护神经元、促进轴突再生的作用。NGF是维持特定的感觉神经元及交感神经元存活所必需的。轴突损伤后，神经元基因表达的变化部分地由摄入神经元的NGF减少所致。周围神经损伤后，若给予外源性NGF可促进感觉神经纤维再生，促进交感神经萌芽与感觉神经元之间建立功能性联系。

脑源性神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor，简称BDNF)能够促进中枢神经系统神经元的出芽再生，增加损伤大鼠脊髓神经元之间的连接(LA.Mamounas等，J Neurosci.20：771-82(2000)；R.Vavrek等，Brain129：1534-45(2006).)。BDNF是一种重要的运动神经元和感觉神经元营养因子，与NGF序列有50％的同源性。BDNF可促进啮齿类动物损伤坐骨神经的再生和髓鞘化。原位杂交分析显示，BDNF在受损神经远端的雪旺细胞和除神经支配的肌纤维中表达。应用BDNF抗体会明显抑制大鼠坐骨神经再生。外源性BDNF还有减轻周围神经损伤引起的溃变的功能。

碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，简称bFGF)作为一种多肽类生长因子，具有广泛的促神经再生作用。在正常神经细胞胞体、轴突、树突近端都有bFGF存在，包括腰段脊髓神经元、坐骨神经的雪旺细胞、朗飞氏结。研究发现，外源性bFGF可促进损伤后雪旺细胞增生、维持神经元正常功能、减少神经元死亡、  促进轴突再生。周围神经横断后，内源性bFGF除了作为神经营养因子扩大轴突直径、增加相关的大直径轴突数量外，还可促进神经的血管生成。

牛血清白蛋白等其它组分主要为细胞的生长代谢所必须的基本物质，维持无血清培养基中的神经元的生长。

上述细胞因子和化合物构成的组方的成份都可以从市场上购买。

发明人对本发明细胞因子和化合物构成的组方及其成分诱导包括神经干细胞分化来的神经元，PC12分化来的成熟神经元，原代皮层神经元和小脑Purkinje神经元分裂的能力等的研究表明，本发明细胞因子和化合物的组方具有较好的诱导神经元分裂的效果。表现为：(1)其诱导分裂产生的子神经元能较好地保持原有神经元的化学性质；(2)诱导分裂产生的子神经元可以保持与靶细胞的结构联系；(3)子神经元的神经纤维可以容易地寻找和达到支配的靶组织；这些因素都大大利于新生神经元的功能重建及中枢神经系统疾患功能恢复。

神经再生的首要条件是使损伤的神经元处于良好的存活状态，本发明细胞因子组方能够促进神经元分裂，分裂的神经元存活状态良好。其次神经再生是要使损伤的神经元突起快速出芽，并促进其生长。发明人研究证实本发明细胞因子组方中细胞因子协同作用强大，可明显促进神经再生。其中结合本发明细胞因子和化合物的组方具有保持细胞存活状态和促进神经元分裂作用，BDNF、NGF具有明确的促进神经快速出芽以及促进其生长的作用，因此本发明细胞因子和化合物的组方不但可以促进神经再生，还具有明确的治疗神经损伤作用。

本发明的优点和有益效果：(1)、本发明能保持神经细胞的存活状态，并且能促进神经元的分裂，为治疗神经系统疾患提供了可能；(2)、本发明还可以促进神经再生，而且诱导分裂产生的子神经元能较好地保持原有神经元的化学性质以及保持与靶细胞的结构联系，子神经元的神经纤维可以容易地寻找和达到支配的靶组织，从而能达到治疗神经损伤的目的；(3)、本发明利用脑组织原位的神经细胞，不必外源细胞的植入，因而技术上简单可行；(4)、本发明组份都是利用现有成份，生产方法简单，成本低。

附图说明

图1.是原代神经元分裂相相差显微镜照片。

a表示有丝分裂前期的相差显微镜照片；

b表示有丝分裂中期的相差显微镜照片；

c表示有丝分裂后期的相差显微镜照片；

d表示有丝分裂晚期的相差显微镜照片。

图2.原代Purkinje神经元分裂的相差显微镜照片。

图3.体外培养各天蒲肯野细胞计数的回归曲线图。

图4.不同培养时间三型蒲肯野细胞所占的柱状图。。

图5.Purkinje神经元分裂形成的子神经元继续分裂照片。

图6.处于分裂中期的Purkinje神经元激光共聚焦照片。

图7.处于分裂后期的Purkinje神经元激光共聚焦照片。

图8.原代皮层神经元激光共聚焦照片。

a和b显示处于有丝分裂早期的神经元；

c、d和e显示处于有丝分裂中期的神经元，染色质被PI标记(红色)。

图9.处于分裂后期的皮层神经元照片。

a显示神经元饱和被PI标记，胞质被NSE免疫细胞化学染色。

b-d显示饱和被PCNA标记，胞质分别被NF-160，SOM和GAD标记。

图10.有丝分裂前期的神经元电镜照片。

图11.有丝分裂中期的神经元电镜照片。

图12.有丝分裂后期的神经元电镜照片。

图13.有丝分裂晚期的神经元电镜照片。

图14.新形成的神经元与其它神经元形成功能联系的电镜照片。

图15.显示了正在分裂神经元具有典型成熟神经元的钠、钾离子通道电位。

图16.细胞因子组方注射到皮层后，注射区周围神经元被BrdU标记情况照片。

图17.细胞因子组方能够通过两神经结合点(A-D)，进入L1脊髓的照片。

图18.显示细胞因子组方促进T起源于6-8脊髓的T7肋间神经进入T12-L2脊髓的PHA-L顺行标记(A-C)照片。

具体实施方式

下面以具体实施例进一步对本发明进行详细说明，但是不对本发明构成任何限制。

实施例1

本发明细胞因子和化合物构成的组方的制备：称取氢化可的松1mg，溶于10ml无水乙醇中，配制成0.01％的母液；称取孕酮1mg，溶于10ml无水乙醇中，配制成0.01％的母液；称取胰岛素100mg，溶于10ml双蒸水中，配制成1％的母液；称取牛血清白蛋白100mg，溶于10ml双蒸水中，配制成1％的母液；称取转铁蛋白2g，溶于10ml双蒸水中，配制成20％的母液；称取腐胺300mg，溶于10ml双蒸水中，配制成3％的母液；称取三碘甲状腺原氨酸20mg，溶于10ml双蒸水中，配制成0.2％的母液；称取亚硒酸钠1mg，溶于10ml双蒸水中，配制成0.01％的母液；将100μgEGF溶于1ml双蒸水中，配制成0.01％的母液；将10μg bFGF溶于100μ110mM Tris缓冲液中(pH7.6，含0.1％BSA)，配制成0.01％的母液；分别吸取0.01％氢化可的松母液9.1μl、0.01％孕酮母液126μl、1％胰岛素母液10ml、1％牛血清白蛋白母液10ml、20％转铁蛋白母液10ml、3％腐胺母液10ml、0.2％三碘甲状腺原氨酸母液10ml、0.01％亚硒酸钠母液1ml、加双蒸水定容至100ml，混和均匀。然后分装成1ml/管，保存于-70℃冰箱中。在实验过程中，再加入EGF和bFGF，使其终浓度分别为为2×10^-4％。溶液中各组分浓度为胰岛素0.1％、牛血清白蛋白0.1％、腐胺0.32％、氢化可的松9.1×10^-5％、孕酮1.26×10^-4％、转铁蛋白2％、三碘甲状腺原氨酸2×10^-2％、亚硒酸钠1.04×10^-4％，EGF2×10^-4％和bFGF2×10^-4％。

实施例2

本发明细胞因子和化合物构成的组方的制备：将10μg BDNF溶于100μl双蒸水中，配制成0.01％的母液；将10μg NGF溶于100μl双蒸水中，配制成0.01％的母液；在实施例1所制成份的基础上，再加入BDNF，使其终浓度为2.5×10^-4％；然后加入NGF，使其终浓度为5×10^-4％。混和均匀，双蒸水定容，制得本发明组方。

实施例3诱导原代皮层和脊髓神经元分裂实验

将大鼠脊髓和皮层神经元进行分离，然后加入大剂量的阿糖胞苷，去除神经干细胞和其它可分裂细胞。然后用Nestin，GFAP和NSE免疫细胞化学检查，确认无任何Nestin免疫阳性细胞，原代神经元细胞占总细胞比例的95％以上。然后加入实施例1所得细胞因子和化合物构成的组方诱导神经元分裂，结果(见图1)发现相当多的神经元都处于M期(有丝分裂期)。图片显示的是处于有丝分裂不同时期的原代皮层和脊髓神经元。

实施例4诱导大鼠小脑原代Purkinje神经元分裂作用。

将大鼠小脑细胞进行培养，然后加入大剂量的阿糖胞苷，去除其它可分裂细胞。运用蒲肯野细胞特异性的Calbindin D28k抗体进行培养细胞的免疫细胞化学鉴定。然后加入实施例1细胞因子和化合物构成的组方诱导神经元分裂，在相差显微镜下观察，结果(见图2)显示培养细胞中部分Purkinje神经元处于M期。

实施例5

按照实施例4的方法进行小脑Purkinje神经元的培养和诱导分裂，在诱导分裂的第2、4、6、8、10天分别取以相同密度接种的小脑神经元，Calbindin D28k免疫细胞化学染色后在光学显微镜下观察，计数20倍物镜视野中calbindinD28k阳性的蒲肯野细胞数量。结果显示加入实施例1细胞因子组方后原代Purkinje神经元的数量明显增加。对结果进行回归曲线分析，发现随着培养天数的延长，Calbindin D28k阳性细胞的数量也增加了(见图3)，增加最明显的时间是在培养的第6-8天。从细胞类型的组成来看(图4)，图4显示，无论培养的早期还是晚期，I型(图4左侧柱)蒲肯野细胞(形态发育较幼稚，胞体较小，突起少，多为双极神经元，分枝很少)都占多数；形态较成熟的III型(图4右侧柱)细胞(胞体明显较周围细胞大，突起较多，一级突起也有很多的分枝)；II型(图4中间柱)细胞(细胞胞体增大，突起增多，分枝也较多，但多为一级突起，树突嵴也较少)属于从I型向III型细胞发育过程中的过渡细胞，因此，其比例会随这两种细胞数量的增减而变化，当I型细胞数量增加时，其所占的比例明显减少。显示随培养天数的增加，细胞数量也增加。

实施例6

在可以连续拍摄的相差显微镜下，观察实施例1细胞因子组方诱导分裂的原代培养神经元，寻找处于有丝分裂不同时期的神经元，然后进行连续拍摄，频率为1次/30min。结果发现，在实施例1细胞因子和化合物构成的组方诱导下，新形成的子代神经元可以连续分裂(见图5)。图5显示在实施例1细胞因子和化合物构成的组方诱导下，Purkinje神经元分裂形成的子神经元仍可继续分裂。

实施例7  诱导分裂的原代培养神经元具有成熟神经元的标志物

为了证明诱导分裂的神经元为成熟神经元，发明人在加入实施例1细胞因子和化合物的组方诱导神经元分裂前，先用Nestin免疫细胞化学检查，未发现任何Nestin免疫阳性标记细胞。排除了神经干细胞和前体细胞分化为神经元的可能。然后再进一步运用免疫荧光双标记技术(Hoechst/PI显示分裂细胞)，免疫细胞化学双标记技术(PCNA显示分裂细胞)，证明了诱导分裂的神经元内表达成熟神经元特异性的标记物(Calbindin D28k/NSE/NF-160/SOM/GAD)，是分化成熟的神经元(见图6～图9)。

图6处于分裂中期的Purkinje神经元激光共聚焦照片，神经元胞体Purkinje神经元特异性标志物Calbindin D28k标记(红色)。染色质位于赤道，被Hoechst标记(蓝色)。

图7处于分裂后期的Purkinje神经元激光共聚焦照片，胞核Hoechst标记(蓝色)。胞质被Calbindin D28k标记(红色)。

图8原代皮层神经元激光共聚焦照片，显示处于有丝分裂早期(a，b)和中期(c，d，e)的神经元，染色质被PI标记(红色)。其细胞质被神经元特异性标志物NSE染色(绿色)；

图9处于分裂后期的皮层神经元，图片a显示神经元胞核被PI标记(红色)，胞质被NSE免疫细胞化学染色(绿色)，图片b-d显示胞核被PCNA标记(紫蓝色)，胞质分别被NF-160，SOM和GAD标记(棕色)，这些都是成熟神经元的标志物。

实施例8诱导皮层神经元分裂的电子显微镜研究

采用实施例3的方法进行大鼠大脑皮层神经元的原代培养和诱导分裂，进行电镜技术的原位固定、包埋后，在相差显微镜下寻找处于有丝分裂不同时期的神经元样细胞，标记后，原位切取，粘于树脂托上，修整包埋块，进行超薄切片，然后进行免疫电镜染色。结果显示这些正在处于不同分裂时相的原代神经元具有特异性的神经元结构，并且正在分裂的神经元可以被NSE胶体金标记。说明正在分裂的神经元具有成熟神经元的标志物(图10-13)。甚至捕捉到正在分裂的神经元可以与其它神经元形成典型的突触(见图14)。提示了分裂的神经元为成熟神经元，还提示这些个正在分裂的神经元可以发挥神经元的功能作用。

图10显示有丝分裂前期的神经元电镜照片，神经元的核周体内没有完整的细胞核(A和B)，在细胞浆内存在许多形态各异的染色质块(Cr)。细胞浆内还可以观察到大量的线粒体(mi)、微管、溶酶体与少量的粗面内质网(RER)。箭头(箭头)所示的是NSE标记的胶体金颗粒。

图11显示有丝分裂中期的神经元电镜照片，纺锤丝存在于两个姐妹染色单体(Cr)之间。分裂神经元的细胞浆内存在大量散在的多聚核糖体(stars)与线粒体(mi)与排列整齐的神经微管(mt)。

图12显示有丝分裂后期的神经元电镜照片，在分裂神经元的中央形成了一个深的凹陷。两个姐妹染色单体靠近细胞的两极，可以清楚的观察到线粒体(mi)结构与胶体金颗粒(箭头)。

图13显示有丝分裂末期的神经元电镜照片分裂神经元内存在两个细胞核，分别位于细胞的两极(A)，分裂神经元的细胞浆内存在大量的多聚核糖体(stars)、粗面内质网(RER)与线粒体(mi)。在分裂神经元的细胞浆内存在许多胶体金颗粒(箭头)。

图14显示有丝分裂末期神经元与其它神经元形成密切的功能联系，甚至典型的突触结构；三个神经突起末端变大形成椭圆形的膨体，与子细胞神经元的突起形成了典型的不对称性突触结构；局部细胞膜明显增厚，电子密度增高；突触前结构内含有大量的清亮小泡。

实施例9处于分裂末期的神经元显示成熟神经元电生理特征

采用实施例3的方法进行大鼠大脑皮层神经元的原代培养和诱导分裂，然后在显微镜下选择处于有丝分裂时期的神经元进行单细胞的膜片钳检测，观察其是否具有成熟神经元的电生理特征。结果显示，它们的静息电位均位于-60-70mV之间。接受一系列的去极化电刺激后，可以见到快速的内向电流和延时的外向电流。数据处理和分析表明，这些分裂神经元有着成熟的Na⁺电流和K⁺电流，Na⁺电流的阈值约为-50mV。这些分裂神经元具有高度的兴奋性，具有成熟神经元的典型的电生理特征(见图15)。图15.显示正在分裂的神经元具有典型成熟神经元的钠、钾离子通道电位。图显示正在分裂的神经元具有成熟神经元的兴奋性电位。

实施例10诱导成年大鼠皮层神经元分裂

将实施例1的组方5μl注射到成年大鼠皮层，用量为5μl/只，5天后，注射120mg BrdU到大鼠腹腔内。5天后，运用多聚甲醛对动物进行灌注固定。取出大脑后，进行免疫化学标记。结果(见图16)显示，部分皮层神经元被BrdU标记，甚至皮层大锥体细胞也被BrdU和NSE免疫双标记，说明局部神经元受实施例1的细胞因子组方刺激，具有分裂的能力。

图16显示实施例1的细胞因子组方注射到皮层后，注射区周围神经元被BrdU标记情况(图16中a)；图B为中性红与BrdU双标记细胞。图16中b-e为NSE与BrdU免疫双标记神经元。

实施例11治疗脊髓损伤实验

将实施例2得到的细胞因子和化合物的组方局部运用于脊髓的断端，可使断端的神经纤维易于生长进入远侧的脊髓，利于脊髓损伤的修复。如图显示脊髓完全横断后，通过N4作用，使神经纤维通过断端，进入远侧脊髓组织，并通过膨体与下位脊髓建立联系(见图17，图18)。图17.脊髓横断后，用T7肋间神经-L1背根桥接完全横断的大鼠脊髓后，实施例2的细胞因子和化合物的组方能够通过两神经结合点(图17中A-D)，进入L1脊髓(E，材料来自图B的小框e)。并且，T7和L1神经接合点，L1进入脊髓处没有明确的神经瘤和癍痕；图18，显示实施例2的细胞因子和化合物的组方促进T起源于6-8脊髓的T7肋间神经进入T12-L2脊髓的PHA-L顺行标记(图18中A-C)。高倍镜下显示这些标记物为神经纤维和膨体。