杂交瘤细胞分泌的uPA抗体对小鼠精子功能的影响

摘要

第一部分、uPA抗体阳性杂交瘤细胞上清的制备。 目的：制备可分泌uPA抗体的杂交瘤细胞，并获得含高效价uPA抗体的细胞上清。 方法：取6～8周龄健康BABL/C小鼠，按单克隆抗体制备技术常规免疫后取尾静脉血，利用间接ELISA检测效价，选择高效价的小鼠，加强免疫后3天取脾脏制备细胞悬液，与骨髓瘤细胞SP2/0融合，经HAT培养基筛选后待杂交瘤细胞克隆长至孔底面积的2/3时，取细胞上清分三个稀释度（原液、稀释2.5倍、5倍、10倍）检测效价。 结果：常规免疫后的小鼠血清效价为1：12800，取脾细胞与SP2/0融合后第7天，镜下既可观察得到杂交瘤细胞呈克隆生长，第10天可见到克隆细胞团。取杂交瘤细胞上清检测效价为1：6400，抗体类型为IgG型，其中196个培养孔中有140个是阳性孔，其融合率为71.4％，杂交瘤细胞染色体数目为94±10，为亲代细胞染色体数之和。 结论：通过常规免疫可得到高效价的IgG抗体，经细胞融合可获得持续分泌uPA抗体的杂交瘤细胞。 第二部分、uPA抗体阳性克隆的细胞上清对小鼠精子功能的影响。 实验一：uPA抗体阳性克隆细胞的上清对小鼠精子活力和活率的影响。 目的：观察不同稀释度的含有uPA抗体的杂交瘤细胞上清，对小鼠精子不同时间点的活力和活率的影响。 方法：取成年雄性小鼠的精子，待上游后，按处理因素不同分4组，A、C组：为阳性对照组，A组稀释度为1：5，C组稀释度为1：10；B、D组为阴性对照组，B组稀释度为1：5，D组稀释度为1：10。分别取处理后10min、20min、30min、40min、50min、60min的精子，在显微镜下计数精子活力和活率。活率计数用伊红Y染色法。对不同稀释度、相同时间点的精子活力和活率进行比较，P<0.05为显著性差异。 结果：在细胞上清稀释5倍时，A组精子的活力在30、40、50、60min与B组比较均有降低（P<0.05），尤其是50min的精子活力（41±4.3）明显低于B组的精子活力（65±6.7),P<0.01；A组的精子活率虽然从30min起就开始降低，但50min时的活率（47±4.2）降低最为显著，与B组的活率（69.3±5.2）比较有统计学意义（P<0.01）。在细胞上清稀释10倍时，C组精子活力从30min起开始下降，此后持续一段时间，在60min的活力（45.3±7.9）与D组同时间点的活力（67±6.1）相比，有显著性差异，P<0.01；而C组精子的活率在40min、50min、60min时与D组比较降低有显著性差异（P<0.05），尤其是在60min时的活率（50.5±5.2）明显低于D组的活率（68.3±4.1），P<0.01。虽然A组与C组相比，A组的活力和活率在相同时间点降低的幅度比C组大，但这种差别没有统计学意义。 结论：杂交瘤细胞所分泌的的含uPA抗体的细胞上清可在体外明显地抑制uPA对精子活力和活率的增加，而且这种抑制是可持续的，细胞上清稀释度的不同，小鼠精子活力和活率降低的幅度不同。提示uPA抗体抗体浓度的不同对小鼠精子功能的抑制也不同。 实验二：uPA抗体阳性克隆细胞的上清对小鼠体外受精的影响。 目的：观察含uPA抗体的细胞上清对小鼠精子的受精能力的影响。 方法：雄性昆明小鼠，处死取精子，待上游后，按处理因素的不同，分为3组，空白组：IVF-30，阳性对照组：抗体阳性细胞上清加IVF-30，阴性对照组：抗体阴性细胞上清加IVF-30。雌性小鼠促排卵后取卵母细胞团，分组同精子；取处理后60min的三组精子分别作用于三组卵母细胞团，使其受精，最终共有8个组，A组为精、卵空白组与抗体阳性细胞上清，B组为精、卵空白组与抗体阴性细胞上清，C组为卵空白组与精子阳性对照组，D组为卵空白组与精子阴性对照组，E组为精、卵阳性对照组，F组为卵阳性对照组与精子阴性对照组，G组为卵阴性对照组与精子阳性对照组，H组为卵阴性对照组和精子阴性对照组。受精24h后，以卵母细胞内出现雌、雄双原核或者卵周隙有明确的第一、第二极体的出现为判断标准，观察其受精率。用χ2检验进行统计处理，P<0.05为显著性差异。 结果：A组受精率为39.1％，B组的受精率（65.8％）经χ2检验比较两组受精率有显著性差异（P<0.05）；C组的受精率为35.6％与D组（46.4％）相比，χ2检验有显著性差异（P<0.05）；与F组的受精率（37.6％）相比，E组的受精率（19.6％）降低，经χ2检验比较，有显著性差异（P<0.05）；G组与H组相比，H组的受精率为58.5％而G组的受精率仅为36.2％，经χ2检验比较，有显著性差异（P<0.05）。 结论：含uPA抗体的细胞上清可明显抑制uPA的作用，降低小鼠精子受精的能力。其可能机制是：该细胞上清一方面降低精子的活力和活率，使到达卵子周围的精子数目减少，另一方面通过抑制卵母细胞团uPA对精子的趋化诱导作用，阻碍精卵接触前的通讯交流，从而最终使得精子受精能力降低。提示：uPA可能是影响精子受精的一个重要因子，uPA抗体可降低精子的受精能力，有望成为抗生育避孕制剂的可能。