门静脉耐受中CDCDFoxp调节性T细胞及Th17细胞的作用及机制研究

摘要

本研究分为四部分：
　　 第一部分：门静脉耐受中CD4+T和CD8+T细胞不同作用
　　 目的：探讨门静脉耐受中不同T细胞成分的作用。
　　 方法：门静脉输注经丝裂霉素处理过的C57小鼠脾细胞给Balb/C，建立门静脉输注模型，使用去增殖的C57小鼠淋巴细胞作为刺激细胞，PVI小鼠或正常Balb/c小鼠作为反应细胞，单向混培后，Alamar Blue检测细胞增殖。于门静脉输注后7d行C57和C3H小鼠心脏移植，观察心脏移植存活。流式分选分选门静脉输注小鼠中CD3+、CD4+、CD8+T细胞，分选后测定分选细胞纯度；过继输注给另一BalB/C，并同时行C57或C3H来源的心脏移植，观察并比较心脏移植物存活时间。于移植后7d取心脏移植物，HE染色检测移植物中淋巴细胞浸润情况。
　　 结果：C57小鼠淋巴细胞刺激后，PVI鼠和正常鼠淋巴细胞增殖的比例分别为（14.5±3.5）%和（31.3±5.6）%，P<0.01。C57小鼠淋巴细胞门静脉输注后，后续移植的C57小鼠心脏存活时间明显延长，而对第三系C3H供心存活时间无明显延长，门静脉输注同种抗原可以诱导抗原特异性的免疫耐受。过继输注PVI小鼠T细胞（CD3+）可以转移门静脉输注所诱导的耐受。CD4+、CD8+T细胞过继输注证实，CD4+T细胞转移抗原特异性的耐受，明显延长C57小鼠移植物存活时间，而CD8+T细胞无此效应。移植物病理检测证实，过继输注PVI小鼠CD4+T后，术后第7d，移植物中淋巴细胞浸润明显减轻，心肌结构基本正常。
　　 结论：门静脉输注同种抗原可以诱导抗原特异性的免疫耐受，过继输注耐受小鼠的CD4+T细胞可以转移耐受，而过继输注耐受小鼠CD8+T细胞无此效应。
　　 第二部分：CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在门静脉耐受中的作用
　　 目的：探讨门静脉耐受模型中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例，及其在诱导耐受中的作用及机制。
　　 方法：于门静脉输注同种抗原后第7，14及21天，取小鼠血、肝及脾脏，流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例。流式细胞仪分选PVI小鼠CD4+CD25+T细胞，以不同的浓度加入C57所刺激的Balb/c小鼠淋巴细胞混培体系中，观察对细胞增殖的影响。分别于门静脉输注后第1，3，5天给予CD25单抗腹腔注射，第7天检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例；并于第7天行C57小鼠的心脏移植，观察移植物存活。门静脉输注后，给予CD25单抗（或同型对照抗体）腹腔注射，ELISPOT检测外周血淋巴细胞分泌IL-2，IL-4，IL-10及IFN-γ的能力；TUNEL染色检测肝内CD4+T细胞CD8+T细胞的凋亡比例。
　　 结果：门静脉输注同种抗原后，CD4+CD25+T细胞的比例明显升高，术后第7天达到高峰，之后逐渐下降，至第21天仍然维持在高于正常小鼠的水平。CD4+CD25+Foxp3+T占CD3+T比例表现出同样的趋势。CD4+CD25+T在体外可以明显抑制C57细胞所刺激的Balb/c小鼠淋巴细胞增殖，并呈现出浓度依赖性。CD25单抗腹腔注射可以清除体内70% CD4+CD25+T细胞，门静脉输注小鼠给予CD25单抗腹腔注射后，后续的心脏移植物存活时间明显缩短，伴随着CD4+CD25+Foxp3+T占CD3+T细胞的比例明显下降。ELISPOT检测发现，门静脉输注后分泌IL-4的细胞比例明显增多，给予CD25单抗清除CD4+CD25+T细胞后，分泌IL-4的细胞比例下降，伴随分泌IL-10，IL-2及IFN-γ的细胞比例增多。门静脉输注后，CD4+T细胞CD8+T细胞的凋亡比例明显增加，给予CD25单抗清除CD4+CD25+T细胞后，CD4+T，特别是CD8+T细胞的凋亡比例明显降低。
　　 结论：门静脉输注同种抗原后，血液、肝脏及脾脏中CD4+CD25+Foxp3+T明显增加，升高的调节性T细胞在耐受的诱导中起重要作用。使用CD25单抗降低CD4+CD25+T细胞水平后，诱导了后续移植器官的排斥反应，并且伴随着IL-4分泌细胞的减少和T细胞凋亡的降低。
　　 第三部分：Th17细胞参与同种异体排斥反应的发生
　　 目的：探讨Th17细胞在同种异体排斥反应中的作用。
　　 方法：建立C57→Balb/c皮肤移植模型，与术后第7天取皮肤移植物，免疫组化检测皮肤移植物中IL-17的表达，以自体皮肤移植为对照。流式分选CD4+T细胞，使用IL-6，TGF-β诱导CD4+T细胞向Th17分化，并观察IL-1β，TNF-α，IL-23在Th17分化中的作用。建立C57→Balb/c裸鼠的皮肤移植模型，过继输注不同浓度的Th17细胞，观察对排斥反应发生的影响。
　　 结果：免疫组化可见，同种异体移植物中腺体结构破坏，有大量Th17细胞浸润，多集中在真皮层。IL-1β，TNF-α可明显增加IL-6和TGF-β诱导的CD4+T细胞向Th17分化，而IL-23在二次刺激中可使CD4+T细胞向Th17分化进一步增强。C57→Balb/c裸鼠的皮肤移植手术近期不被排斥，给予体外诱导的Th17细胞后皮肤移植物的存活时间明显缩短，且与输注的Th17细胞浓度呈负相关。
　　 结论：IL-6和TGF-β是Th17所必须的细胞因子，IL-1β，TNF-α，IL-23在维持Th17增殖和存活中起重要作用。Th17参与了同种排斥反应的发生。
　　 第四部分：门静脉耐受过程中CD4+CD25+Foxp3+T细胞和Th17的相互作用
　　 目的：探讨门静脉耐受中CD4+CD25+Foxp3+T和 Th17细胞的相互作用。
　　 方法：C57脾细胞Balb/c门静脉输注后第7天行C57小鼠皮肤移植，以Balb/c小鼠同基因输注为对照，移植后第7天取皮肤移植物，Wetern-Blot检测移植物中IL-17及Foxp3的表达。体外诱导CD4+CD25+T细胞，在naive CD4+CD25+T和induced CD4+CD25+T培养体系中分别加入IL-6，观察对CD4+CD25+T细胞分化的影响。在Th17细胞培养体系中加入IL-2（或IL-2+TGF-β），观察对Th17分化的影响。建立同种门静脉输注模型，并输注IL-6或Th17观察对后续移植皮肤存活的影响。
　　 结果：同种门静脉输注与同基因门静脉输注相比，后续移植物中Foxp3的表达明显升高，而IL-17的表达明显降低。体外实验证实IL-6可诱导CD4+CD25+T细胞向Th17转化，且活化的CD4+CD25+T细胞接受IL-6的刺激后更易于向Th17转化。IL-2和TGF-β共同存在的条件下，Th17可向CD4+CD25+T细胞转化。过继输注Th17或IL-6均可打破门静脉耐受，后续移植的皮肤移植物明显缩短。
　　 结论：门静脉输注可以使移植物中Treg的比例明显升高，而Th17的比例明显降低。Treg和Th17在体外实验中可以互相转化，分化方向取决于细胞因子环境。过继输注IL-6和Th17可以打破已建立的门静脉耐受。