Th17及CD4+CD25+调节性T细胞在大鼠肝移植急性排斥及耐受中的作用机制研究

摘要

背景：尽管免疫抑制剂的临床广泛使用，急性排斥反应(acute rejection，AcR)仍是肝移植早期失败的主要原因，因此抑制急性排斥并诱导免疫耐受是解决该难题的最佳方案。近年研究表明，肝脏急性排斥反应除与Th1/Th2轴平衡漂移有关外，还和Th17/Treg轴密切相关。因此，调节Th17向Treg方向偏移，极可能是诱导免疫耐受形成的另一重要机制。目前，Th17/Treg平衡在肾脏、心脏、胰岛及皮肤移植等方面报道较多，而在肝移植方面较少，且缺乏对其机制的深入研究。因此，阐明肝移植急性排斥中Th17/Treg轴何时失衡、如何失衡以及其关键因子在急性排斥与耐受中充当的角色均具有重要意义。
　　第一部分、近交系大鼠肝移植急性排斥及耐受模型的建立
　　目的:建立近交系大鼠肝移植急性排斥及耐受模型，探讨其构建技巧及特点。
　　方法:选择近交系大鼠LEW和BN为建模对象，采用“改良kamada法”行大鼠原位肝移植，根据供受体不同分为2组:①REJ组(LEW-BN);②TOL组(BN-LEW)。术后观察两组受体的一般情况及生存时间，并于术后第1，3，5，7天获取肝组织及外周血，生化检测肝功能(ALT、AST、TBIL)动态变化，HE染色观察肝脏病理改变并计算排斥活动系数(RAI)。
　　结果:
　　(1) REJ组大鼠术后逐渐出现皮毛粗糙，精神萎靡，活动少，进食少，尿色深黄，而TOL组大鼠的一般情况好，进食较多，尿色正常;前者大鼠均于13内死亡，TOL组大鼠的平均生存时间(59.67±7.03天)明显长于REJ组(11.32±0.83天)，两组的差异明显(P＜0.05);
　　(2)肝功能结果显示:术后第1天，两组的肝功能无明显差异（P＞0.05）;术后第3天起，REJ组的血清ALT、AST及TBIL增高，于第7天达峰值。而TOL组无明显变化，两组比较有显著差异(P＜0.05);
　　(3)术后3天REJ组肝脏组织出现明显的形态学变化:汇管区见广泛的炎性浸润（以淋巴细胞为主，同时伴单核及中性粒细胞），胆管及门静脉明显受累;肝小叶结构失常伴肝细胞空泡状变性，有局灶性出血及坏死;而TOL组组织形态学无明显改变。比较两组排斥活性系数(RAI)，有显著性差异(p＜0.05)。
　　结论:LEW-BN符合急性排斥反应的典型特点，并于第7天达反应高峰，该模型可以作为研究肝移植急性排斥反应的理想动物模型，而BN-LEW术后未见明显排斥反应，是免疫耐受组合。
　　第二部分、大鼠肝移植急性排斥与耐受中Th17、 Treg细胞及其相关因子的动态变化
　　目的:探讨Th17细胞及其相关因子（RORγτ、L-17、L-23、IL-6）和Treg细胞及相关因子(FoxP3、IL-10、TGFβ1)在大鼠急性排斥和耐受中的动态变化及其作用。
　　方法:采用“改良kamada法”行大鼠原位肝移植，分为2组:①REJ组(LEW-BN);②TOL组(BN-LEW)。术后第1，3，5，7天获取肝组织及外周血，FCM检测外周血Th17、Treg细胞数量变化，ELISA检测血清中Th17相关因子(IL-17、IL-23、IL-6)及Treg相关因子(IL-10，TGFβ1)含量，Western blot检测肝组织中上述细胞因子的蛋白表达，RT-PCR检测肝组织RORγτ及FoxP3mRNA表达水平。
　　结果:
　　(1) FCM显示REJ组PBMC中Th17细胞比例增多，Treg细胞比例减少，Th17/Treg明显失衡;而在TOL组，Th17/Treg比例无显著变化。
　　(2) RT-PCR表明REJ中RORγt mRNA表达上调，FoxP3mRNA表达下调;而TOL组则呈相反趋势。两组比较有明显的统计学差异(p＜0.05)。
　　(3) Western blot及ELISA证实急性排斥反应时，肝组织和血清中Th17相关细胞因子(IL-17、IL-23及IL-6)表达上调，而Treg相关细胞因子（IL-10、TGFβ1）表达下调;耐受组中两者则呈相反趋势。结论:急性排斥反应时，Th17细胞数量增加，其相关因子（RORγτ、IL-17、IL-23、IL-6）表达上调，而Treg细胞减少，其相关因子(FoxP3、IL-10、TGFβ1)表达下调;耐受时则呈相反趋势。提示Th17/Treg失衡可能导致了急性排斥反应的发生。
　　第三部分、过继转移CD4+CD25+Treg细胞对大鼠肝移植急性排斥反应的影响
　　目的:探讨过继转移CD4+CD25+Treg细胞对大鼠肝移植急性排斥反应的影响及其机制。
　　方法:分离供体(LEW)脾淋巴细胞静脉注入受体(BN)，获得免疫源性后分离BN脾脏单个核细胞(SPMC)，继以MACS分选出CD4+CD25+Treg，并证实其为活性Treg(CD4+CD25+FoxP3+Treg);以“改良Kamada”法建立大鼠肝移植排斥模型后，随机分为:过继转染组(AT)和非过继转染组(NAT)。观察术后生存率，于术后7d获取肝脏及血液标本，观察肝脏组织病理变化，生化检测血清ALT、AST及TBIL变化，Western Blot检测肝组织中IL-17、IL-23、IL-10、TGFβ1、IL-4及IFN-γ蛋白表达水平， ELISA检测血清IL-17、IL-23、IL-10、TGFβ1、IL-4及IFN-γ含量。
　　结果:通过混合淋巴反应及RT-PCR证实了经供体(LEW)脾淋巴细胞刺激分选的受体(BN) CD4+CD25+Treg为具有活性的Treg，即CD4+CD25+FoxP3+Treg。过继转移CD4+CD25+Treg后，能减轻AcR，延长受体生存时间;Western Blot和ELISA检测结果显示:AT组IL-17、IL-23表达量低于NAT组(P＜0.05);而IL-10、TGFβ1表达量却明显高于NAT组(P＜0.01)。同NAT组中比较，AT组INF-γ、 IL-4均下调，且较其他因子含量低(P＜0.05)，表明过继转移CD4+CD25+Treg时，受体鼠体内Th1、Th2型免疫反应均被抑制，可能与Treg直接抑制CD4+/CD8+T淋巴细胞增殖有关。
　　结论:过继转移CD4+CD25+Treg，能减轻急性排斥反应，延长大鼠生存时间;并通过上调Treg细胞因子（IL-10、TGFβ1）和下调Th17细胞因子(IL-17、IL-23)的表达，从而实现Th17/Treg的免疫偏移;另外，还同时抑制体内Th1型免疫反应，有利于免疫耐受的诱导。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 近交系大鼠肝移植急性排斥及耐受模型的建立

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第二部分 大鼠肝移植急性排斥与耐受中Th17、Treg细胞及其相关因子的动态变化

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第三部分 过继转移CD4+CD25+Treg细胞对大鼠肝移植急性排斥反应的影响

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

全文总结

文献综述

致谢

攻读博士学位期间发表的论文