p55PIK:新的肿瘤分子治疗靶点

摘要

第一部分
　　 目的：Class IA PI3Ks同多种肿瘤的发生发展相关，其调节亚基和催化亚基的点突变或表达异常能够促进肿瘤细胞增殖、促进肿瘤转移。PI3Ks调节亚基能够同催化亚基形成稳定的复合物，调控催化亚基的活性，调节亚基在结构上的差异决定了调节亚基功能的差异，本部分研究旨在明确p55PIK在肿瘤发生发展中的作用，探讨p55PIK调控细胞增殖机理。
　　 方法：构建p55PIK和缺失突变体p55PIKdel（缺失p55PIK特有的N24结构域）的质粒和腺病毒载体，在细胞内高表达p55PIK和p55PIKdel，流式细胞术检测细胞周期、Ki-67表达、DNA合成的变化，Western Blot检测PI3K-AKT通路的激活情况；通过荧光定位和Western Blot明确PI3Ks调节亚基和催化亚基的亚细胞定位，比较p55PIK和p55PIKdel亚细胞定位的差异，以明确p55PIK特有的N24结构域的功能；动物实验观察高表达p55PIK对体内肿瘤生长的影响。
　　 结果：成功构建p55PIK和缺失突变体p55PIKdel的腺病毒载体，细胞内高表达p55PIK和p55PIKdel后均能够促进肿瘤细胞增殖，促进DNA合成，p55PIK的作用较p55PIKdel更加明显（P＜0.05），高表达p55PIK和p55PIKdel均能激活PI3K-AKT通路，两者间AKT的磷酸化水平无显著差异；荧光定位和Western Blot显示PI3Ks不同的调节亚基和催化亚基间的亚细胞定位不同，p55PIK和p110β主要分布于细胞核中，p85α、p85β、p110α主要分布在细胞浆中，p55PIK和p55PIKdel亚细胞定位发现p55PIKdel仅出现在细胞浆内；高表达p55PIK和p55PIKdel的细胞在动物体内成瘤性增强，肿瘤生长加快，p55PIK促进肿瘤生长的能力较p55PIKdel强（P＜0.05）。
　　 结论：p55PIK能够通过PI3K-AKT通路依赖性机制和N24结构域介导的p55PIK特有功能（PI3K-AKT非依赖性机制）促进肿瘤细胞增殖，p55PIK氨基端的N24结构域能够使p55PIK
　　定位于细胞核，介导了p55PIK区别于其他调节亚基特有的功能，p55PIK能够依赖其N24结构。
　　 第二部分
　　 目的：p55PIK氨基端N24结构域介导了p55PIK调控细胞周期和DNA合成的AKT非依赖性途径，p55PIK能够依赖其N24结构域同Rb等蛋白结合，调控细胞周期和DNA合成，体外导入N24能够阻断p55PIK同这些蛋白的结合。本部分研究旨在通过体内和体外实验探讨腺病毒携带N24结构域对肿瘤的治疗作用。
　　 方法：构建N24结构域的腺病毒载体，细胞内高表达N24，流式细胞术检测细胞周期、DNA合成、细胞凋亡，Western Blot检测PI3K-AKT通路的激活情况；动物实验观察高表达N24对肿瘤生长的抑制作用。
　　 结果：成功构建N24腺病毒载体Ad-N24-GFP，在Rb阳性肿瘤中，细胞内高表达N24后能够抑制细胞增殖，阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制细胞内DNA合成；在Rb缺失的肿瘤细胞中，N24也能够抑制细胞增殖，阻滞细胞周期于S和G2/M期，抑制细胞内DNA合成；体内实验中，N24能够抑制Rb阳性及Rb阴性肿瘤的裸鼠移植瘤生长，降低移植瘤内的Ki-67表达，抑制移植瘤细胞的DNA合成。
　　 结论：N24能够通过Rb依赖性和Rb非依赖性机制抑制肿瘤细胞细胞周期进程，抑制DNA合成，体内有效抑制肿瘤生长；p55PIK是有效的分子治疗靶点，N24可望开发成为特异性针对p55PIK的抗肿瘤药物。
　　 第三部分
　　 目的：腺病毒表达N24能够阻断p55PIK介导的信号传导通路，在体内能够有效抑制肿瘤生长，但腺病毒的生物安全性限制了其临床应用，TAT能够介导生物大分子高效进入细胞，利用TAT携带N24进入细胞能够较好的解决N24入胞的难题。本部分研究旨在明确穿膜融合多肽TAT-N24对肿瘤的治疗作用。
　　 方法：构建TAT-N24的原核表达载体，利用蛋白质纯化技术纯化融合多肽TAT-N24，以TAT-N24作用于肿瘤细胞后流式细胞术检测细胞周期、DNA合成。在血液系统肿瘤中检测TAT-N24对白血病细胞细胞增殖、细胞分化的影响；动物实验观察穿膜融合多肽TAT-N24对肿瘤生长的抑制作用。
　　 结果：成功构建N24的原核表达载体pTAT-N24，在实体肿瘤和血液系统肿瘤中TAT-N24均能够高效进入细胞，抑制细胞增殖，抑制细胞内DNA合成；除此，在白血病中，p55PIK呈高表达状态，TAT-N24能够通过抑制p55PIK的功能诱导细胞分化；体内实验中，TAT-N24能够有效进入肿瘤内部，抑制肿瘤的裸鼠移植瘤生长，抑制肿瘤转移，降低移植瘤内的Ki-67表达，抑制移植瘤细胞的DNA合成。
　　 结论：TAT-N24融合多肽能有效进入细胞，抑制肿瘤细胞细胞周期进程，抑制DNA合成；在血液系统肿瘤中TAT-N24能够有效诱导白血病细胞向单核巨噬细胞分化，TAT-N24通过抑制肿瘤的细胞周期进程，抑制肿瘤转移，促进肿瘤细胞分化三重机制抑制肿瘤进展。
　　 第四部分
　　 目的：p55PIK能够依赖N24结构域通过Rb依赖性和非依赖性途径调控细胞周期进程。本部分研究旨在明确p55PIK依赖N24结构域调控细胞周期进程的Rb非依赖性途径。
　　 方法：以TAT-N24为诱饵蛋白进行蛋白质亲和层析，质谱鉴定同N24结合的蛋白，利用免疫共沉淀和荧光共定位等技术确定蛋白质之间的结合，利用分子生物学技术确定蛋白质结合域及相互结合的生物学意义。
　　 结果：利用TAT-N24蛋白质亲和层析和质谱鉴定，确定增殖细胞核抗原（PCNA）能够同TAT-N24结合，免疫共沉淀和荧光共定位证实p55PIK能够经由N24结构域结合PCNA，体外结合实验证实二者为直接结合。p55PIK能够和PCNA、PI3K催化亚基p110β形成复合体。
　　 结论：p55PIK能够经由N24结构域直接结合PCNA。p55PIK-PCNA结合介导了p55PIK调控细胞周期的Rb非依赖性机制，p55PIK通过结合PCNA调节细胞的S和G2/M期细胞周期进程，调控DNA合成。

目录

论文说明：缩略词表

声明

引 言

第一部分p55PIK在肿瘤发生发展中的作用

第二部分腺病毒携带p55PIK氨基端N24结构域在肿瘤治疗中的应用

第三部分穿膜融合多肽TAT-N24对肿瘤的治疗作用研究

第四部分p55PIK调控肿瘤细胞周期机制探讨

全文总结

文献综述磷脂酰肌醇3-激酶与肿瘤

附录

致 谢