糖原合成激酶-3β在胰腺癌分子靶向治疗中的作用及机制的探讨

摘要

第一部分GSK-3β在胰腺癌组织中的表达及其临床意义
　　 目的：本研究旨在检测胰腺癌中GSK-3β的表达，探讨GSK-3β的表达与胰腺癌临床病理特征的关系，进而深入探讨其在胰腺癌发生、发展中的作用。
　　 方法：运用免疫组织化学SP法检测65例胰腺癌组织及10例癌旁胰腺组织中GSK-3β的表达。
　　 结果：在65例胰腺癌标本中33例出现GSK-3β的阳性表达，而在癌旁胰腺组织未检测到GSK-3β的阳性表达(P<0.01)。GSK-3β蛋白的表达与胰腺癌患者的年龄、性别和肿瘤大小无关，但与胰腺癌的分化程度、转移和临床分期有关(P<0.05)。
　　 结论：GSK-3β的高表达在胰腺癌的发生发展和浸润转移过程中起着重要作用。GSK-3β可能与胰腺癌患者的预后的密切相关。
　　 第二部分靶向人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒的构建及其在人胰腺癌细胞株PANC-1中的稳定表达
　　 目的：构建针对人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒，并筛选出基因沉默效果最佳的shRNA质粒表达载体；转染人胰腺癌细胞株PANC-1，建立稳定表达GSK-3βshRNA的细胞模型。
　　 方法：针对GSK-3β基因的mRNA序列设计，分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体，经大肠杆菌扩增，酶切，PCR，测序鉴定，转染胰腺癌PANC-1细胞，Real-time PCR检测GSK-3βmRNA被抑制情况。选取效应最强的重组质粒和阴性对照质粒转染的PANC-1细胞，经G418筛选后，建立稳定表达GSK-3βshRNA的PANC-1细胞株（实验组）和稳定表达control shRNA的PANC-1细胞株（阴性对照组），未转染的PANC-1细胞株设为空白对照组。采用荧光显微镜和FCM观察细胞的转染情况；Real-time PCR和Western blot分析GSK-3β的表达。
　　 结果：1、经测序证实，成功构建GSK-3βshRNA真核表达质粒，插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致；2、重组质粒瞬时转染PANC-1细胞后，GSK-3βmRNA明显下调（P<0.05），其中以2号重组质粒效应最强；3、重组质粒稳定转染后检测PANC-1细胞中GSK-3β的表达，Real-time PCR和Western blot结果均提示：与空白对照组和载体对照组比较，实验组中GSK-3βmRNA和蛋白的表达均显著降低（P<0.05）。
　　 结论：本研究成功构建了携带以GSK-3β为靶向的shRNA的重组质粒。经脂质体途径稳定转染的PANC-1细胞，该shRNA能够显著抑制GSK-3β的表达。该实验为进一步研究GSK-3β的功能和以其为靶点的肿瘤的基因治疗提供了基础。
　　 第三部分体外实验：RNA干扰GSK-3β对胰腺癌细胞增殖、凋亡、周期和侵袭能力的影响
　　 目的：本实验拟在体外观察基因沉默GSK-3β对胰腺癌PANC-1细胞的增殖、凋亡、周期和侵袭能力的影响，并初步探讨相关的分子机制及GSK-3β作为胰腺癌治疗靶点的可能性。
　　 方法：实验分组如下：空白对照组为未转染的PANC-1细胞；载体对照组为稳定转染control shRNA的PANC-1细胞；实验组为稳定转染GSK-3βshRNA的PANC-1细胞。MTT法连续7d检测各组细胞的OD值，并绘制出细胞的生长曲线；FCM检测细胞的凋亡和周期；Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力；Real-time PCR检测各组细胞中bcl-2、cyclin D1、VEGF、HIF-1αmRNA的表达；Western blot检测各组细胞中bcl-2、cyclin D1、HIF-1α蛋白的表达；ELISA检测PANC-1细胞培养上清中VEGF蛋白的浓度；EMSA检测PANC-1细胞中NF-κB的DNA结合活性。
　　 结果：与对照组比较，转染GSK-3βshRNA的PANC-1细胞生长速度明显减慢；凋亡率明显增加；而且处于G0/G1期细胞比例显著升高，S期细胞比例显著降低，发生明显的G1期阻滞（P<0.05）。实验组PANC-1细胞中bcl-2、cyclin D1、VEGF基因和蛋白的表达显著下调，NF-κB的DNA结合活性降低（P<0.05）。GSK-3β沉默的PANC-1细胞中HIF-1α基因和蛋白的表达出现不一致的变化。
　　 结论：GSK-3β可能在胰腺癌细胞的增殖、存活和侵袭中具有重要作用，阻断GSK-3β的表达可望成为胰腺癌分子靶向治疗的新途径。
　　 第四部分体内实验：建立胰腺癌的移植瘤模型进一步研究RNA干扰GSK-3β对肿瘤生长及血管生成的影响
　　 目的：探讨基因沉默GSK-3β对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长及血管生成的影响。
　　 方法：人胰腺癌PANC-1细胞接种于裸鼠皮下，建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型，分为空白对照组（种植未转染的PANC-1细胞）、载体对照组（种植转染control shRNA的PANC-1细胞）和实验组（种植转染GSK-3βshRNA的PANC-1细胞），测量各组移植瘤的重量和体积，并计算抑瘤率；免疫组化SP法检测PCNA和FⅧ蛋白的表达，并计算增殖指数（SPF）和微血管密度（MVD）；Real-time PCR和Western blot检测VEGF基因和蛋白的表达。
　　 结果：实验组移植瘤的重量和体积显著低于对照组(P<0.05)，抑瘤率为35.27％；实验组SPF和MVD值均小于对照组(P<0.05)；实验组移植瘤的VEGF基因和蛋白的表达较对照组显著降低(P<0.05)。
　　 结论：在体内，基因干扰GSK-3β的表达可以显著抑制PANC-1细胞接种的裸鼠皮下移植瘤的生长和新生血管的形成，该效应可能与其下调VEGF的表达有关。

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论文说明：全文缩略词表

声明

前言

第一部分糖原合成激酶-3β在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

第二部分靶向人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒的构建及其在人胰腺癌细胞株PANC-1中的稳定表达

第三部分体外实验：RNA干扰GSK-3β对胰腺癌细胞增殖、凋亡、周期和侵袭能力的影响

第四部分体内实验：建立胰腺癌的移植瘤模型进一步研究RNA干扰GSK-3β对肿瘤生长及血管生成的影响

第五部分RNA干扰GSK-3β增强化疗药物敏感性的实验研究

小结

综述：糖原合成激酶-3：肿瘤治疗的新靶点

附录在校攻读学位期间发表论文

致谢