转录因子Osterix在氟性骨损伤骨周化骨中的作用研究

摘要

氟性骨损伤（fluoride bone injury）是由于机体长期摄入过量氟而引起的以骨代谢过程紊乱为主要病理特征的慢性代谢性骨病。氟性骨损伤骨周化骨是一种特殊的异位骨化形式（heterotopic ossification），其临床表现主要为广泛性骨质增生硬化、肌腱韧带钙化等，是氟性骨损伤患者致残、致瘫的重要原因。通过大量的体外细胞培养观察和动物实验，有充分依据证明成骨细胞活跃和骨转化加速是氟性骨损伤的特征性病变。骨代谢局部网络相关因子的调控作用是氟性骨损伤骨转换加速的机制之一。
　　 锌指结构转录因子Osterix 参与成骨细胞的分化和骨形成，特异表达于成骨细胞分化和钙化过程中，促进成骨细胞的分化、成熟、膜成骨、软骨化骨及矿化过程，调控许多重要成骨基因的表达，如骨钙素（osteocalcin）、骨粘素（osseomucin）、骨桥蛋白（osteopontin）、骨唾液酸蛋白（bonesialoprotein）和Ⅰ型胶原蛋白（collagen typeⅠ）等。研究证明Osterix 具有促进成骨细胞分化和异位骨化的作用。核心结合因子α1（core binding factoralpha 1，Cbfa1，又称Runx2，）是成骨细胞开始分化的最早最特异的标志性基因，高限制性地表达于骨中。因此，Cbfa1和Osterix是成骨过程中必不可缺的转录因子。
　　 绝大数疾病的发生都是环境和基因相互作用的结果。本研究通过血清Osterix、Cbfa1 蛋白浓度的检测，分析氟暴露人群及氟性骨损伤骨周化骨中Osterix、Cbfa1 蛋白浓度的改变，寻找氟性骨损伤骨周化骨的早期损伤效应的监测指标；探讨Osterix基因与氟性骨损伤骨周化骨的易感性，阐述Osterix基因在氟性骨损伤骨周化骨发生发展中的可能作用，以期为氟性骨损伤的防治提供新的靶点，为氟危害的进一步研究提供理论依据。
　　 目的：通过血清Osterix和Cbfa1蛋白浓度以及Osterix基因外显子2（exon2141-1042 bp）的突变检测，分析氟暴露及氟性骨损伤骨周化骨中Osterix和Cbfa1蛋白浓度的变化及血氟、尿氟、Osterix、Cbfa1蛋白浓度之间的相关性，构建氟性骨损伤骨周化骨相关危险因素的Logistic 回归模型，探讨Osterix基因与氟性骨损伤骨周化骨的易感性以及Osterix在氟性骨损伤骨周化骨发生发展中的可能作用。
　　 方法：选取湖北某铝业集团连续工作5年以上男性作业工人，根据所在车间的不同随机选择研究对象，其中包括：电解车间工人176人；铝杆及铝板带车间工人28人；机关及质检工人22人。并在研究对象知情同意的原则下采集生物材料。根据氟斑牙诊断标准及骨骼X线拍片（骨盆正位片及左侧桡骨正位片）判定结果将研究对象划分为：①有氟性骨损伤骨周化骨工人75人（简称骨损伤组），均来自电解车间。并按骨损伤程度将研究对象分为两组：骨损伤轻度组（30人）
　　 和骨损伤重度组（45人）；②有氟斑牙但无骨周化骨工人22人（简称氟斑牙组），其中电解车间16人，铝杆及铝板带车间4人，机关及质检工人2人；③氟暴露但无氟斑牙且无氟性骨损伤骨周化骨组工人129人，其中，电解车间85人（简称高氟组），铝杆及铝板带车间工人24人（简称低氟组）；机关及质检工人20人（简称对照组）。采用ELISA 法测定血清中Osterix和Cbfa1 蛋白浓度，Logistic 回归方法构建氟性骨损伤骨周化骨危险因素的模型；采用HRM、DNA测序方法检测Osterix基因（位于exon2 141-1042bp）的3个SNP 位点。
　　 结果：1）低氟组Osterix 蛋白浓度为（1159.20±387.58）ng/ml，高氟组Osterix蛋白浓度为（743.81±492.41）ng/ml，对照组Osterix 蛋白浓度为（860.09±410.98）ng/ml，低氟组Osterix 蛋白浓度高于对照组和高氟组，差异有统计学意义（P<0.05）；低氟组Cbfa1 蛋白浓度为（916.40±360.21）ng/ml，高氟组Cbfa1 蛋白浓度为（629.43±430.47）ng/ml，低氟组Cbfa1 蛋白浓度高于高氟组，差异有统计学意义（P<0.05）；2）氟斑牙组Osterix 蛋白浓度为（1216.20±368.89）ng/ml，骨损伤组Osterix 蛋白浓度为（802.61±516.55）ng/ml，对照组Osterix 蛋白浓度为（860.09±410.98）ng/ml，氟斑牙组Osterix 蛋白浓度高于对照组和骨损伤组，差异有统计学意义（P<0.05）；氟斑牙组Cbfa1 蛋白浓度为（1087.00±287.53）ng/ml，骨损伤组Cbfa1 蛋白浓度为（753.28±486.40）ng/ml，氟斑牙组Cbfa1 蛋白浓度高于骨损伤组，差异有统计学意义（P<0.05）；骨损伤轻度组及重度组Osterix 蛋白浓度为（797.88±486.32）ng/ml和（806.72±516.44）ng/ml，低于氟斑牙组Osterix 蛋白浓度，差异有统计学意义（P<0.05）；骨损伤轻度组及重度组Cbfa1 蛋白浓度为（726.38±494.43）ng/ml和（776.68±491.79）ng/ml，低于氟斑牙组Cbfa1 蛋白浓度，差异有统计学意义（P<0.05）；3）骨损伤组血氟与Osterix和Cbfa1 蛋白浓度的相关系数r 值分别-0.434、-0.469，尿氟与Cbfa1 蛋白浓度的相关系数r 值为-0.436，差异有统计学意义（P<0.05）；对照组血氟、尿氟与Osterix、Cbfa1 蛋白浓度的相关系数r 值分别为-0.227、-0.274、-0.075、-0.058，差异无统计学意义（P>0.05）；Osterix与Cbfa1 蛋白浓度的相关系数r 值在骨损伤组及对照组中分别为0.897、0.878，差异有统计学意义（P<0.01）；4）在Logistic 回归模型中，低浓度的血氟（血氟≤0.17 mg/L 及0.17 mg/L<血氟≤0.20 mg/L）与高浓度的血氟（血氟>0.20mg/L）与相比，OR 值分别为0.244和0.264（P=0.039、0.033），B 值为-1.409和-1.333；低浓度的尿氟（尿氟≤2.00mg/L 及2.00<尿氟≤4.00 mg/L）与高浓度的尿氟（尿氟>4.00 mg/L）与相比，OR 值分别为0.051和0.086（P=0.000、0.000），B 值为-2.978和-2.451；低水平的Osterix 蛋白浓度（400.00 ng/ml＜Osterix蛋白浓度≤800.00 ng/ml和800.00ng/ml1200.00 ng/ml）相比，OR 值分别为18.148、5.746（P=0.044、0.030），B 值为2.899和1.749 ；低水平的Cbfa1 蛋白浓度（800.00ng/ml1200.00 ng/ml）相比，OR 值为0.151（P=0.016），B 值-1.892。5）Osterix基因（位于exon2 141-1042bp）三个位点的基因型在损伤对照之间的基因型相同，分布无差异，均为纯合子，分别为CC、GG、CC。
　　 结论：1）在低氟暴露、低氟负荷时，Osterix和Cbfa1 蛋白浓度升高，而在高氟暴露、高负荷时Osterix和Cbfa1 蛋白浓度降低，即随着氟暴露浓度及氟负荷的增加，Osterix、Cbfal 蛋白浓度呈降低的趋势；2）机体发生氟斑牙但无骨损伤时，Osterix和Cbfa1 蛋白浓度升高，而在骨损伤后Osterix和Cbfa1 蛋白浓度降低，即随着氟性骨损伤骨周化骨的发生及损伤程度的加重，Osterix、Cbfal 蛋白浓度也呈降低的趋势，Osterix和Cbfa1 蛋白浓度降低的拐点可能是氟性骨损伤骨周化骨发生的起点； 3）骨损伤组Osterix、Cbfa1 蛋白浓度与血氟、尿氟呈负相关，即Osterix、Cbfa1 蛋白浓度随血氟、尿氟的升高呈降低的趋势；而骨损伤组与对照组中Osterix 蛋白浓度与Cbfa1 蛋白浓度呈正相关，即Osterix 蛋白浓度随Cbfa1 蛋白浓度升高而升高；4）回归分析中，高血氟水平（血氟>0.20mg/L）和高尿氟水平（尿氟>4.00 mg/L）、高水平的Cbfa1 蛋白浓度（Cbfa1 蛋白浓度>1200.00ng/ml）以及Osterix 蛋白浓度在大于400.00ng/ml 且小于等于1200.00ng/ml的范围时，发生氟性骨损伤骨周化骨的风险增高。5）氟性骨损伤骨周化骨患者中，Osterix基因外显子2 上发现碱基的突变及单核苷酸多态性，故锌指结构转录因子Osterix与氟性骨损伤骨周化骨的易感性有待进一步研究。综上所述，在低氟暴露、低氟负荷及机体发生氟斑牙时，Osterix和Cbfa1 蛋白浓度升高，而在高氟暴露、高负荷及骨损伤后时，Osterix和Cbfa1 蛋白浓度降低，Osterix和Cbfa1 蛋白浓度降低的拐点可能是氟性骨损伤骨周化骨发生的起点。因此，我们认为Cbfa1和Osterix的蛋白浓度可以作为氟性骨损伤骨周化骨早期损伤效应的监测指标。

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