9-硝基喜树碱脂质体抗肝癌作用研究

摘要

时至今日，恶性肿瘤的治疗仍然是一个世界性的难题。除了手术治疗之外，化学药物治疗是肿瘤治疗最为重要的手段，然而毒副作用过大是目前化疗药物治疗肿瘤最大的障碍，过高的毒副作用迫使给药剂量降低，给药剂量的下降导致了药物的治疗效果下降。这个特点在细胞毒药物上反应的尤为明显，大多数细胞毒药物在体外非常有效，但在体内对肿瘤细胞和正常细胞表现为不加选择的杀伤，引起了包括恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制和肾衰竭等一系列副作用，因此化疗药物的非特异性限制了药物的抗肿瘤效果。肿瘤化疗过程中，面临的一个难题是如何将足量有效的化疗药物传递到肿瘤组织周围的同时最大程度的降低药物在正常组织的分布，从而降低药物的毒副作用。
　　 药物传递系统（DDS）尤其是纳米药物传递系统（NDDS）的出现为化疗药物的给药提供了新的手段。NDDS作为肿瘤化疗药物的纳米载体，可以通过改变药物动力学和生物分布来改善传统化疗药物的药理学特性。
　　 喜树碱（CPT）是从中国特有的珙桐科植物喜树中提取的一种生物碱，二十世纪六十年代被发现具有良好的抗肿瘤作用。9-硝基喜树碱(9NC)是CPT的衍生物，研究发现9NC具有极强的抗肿瘤效果，但是9NC不溶于水，口服后生物利用度低等原因阻碍了9NC的临床应用。更为重要的是9NC的内酯型结构是其发挥抗肿瘤作用的关键，而9NC单体在生理状态的弱碱性环境中极易转换为羟酸盐型结构，导致9NC抗肿瘤效果显著下降。
　　 目的：在本项研究中，利用脂质体作为纳米载体，构建了9-硝基喜树碱脂质体纳米药物（9NC-LP）。通过观察9NC和9NC-LP在体外、体内对肝癌细胞株生长的抑制作用，研究在与脂质体结合前后9NC抗肿瘤效果的改变；通过观察9NC和9NC-LP在体外、体内对肝癌细胞周期和凋亡的影响初步探讨药物抗肿瘤的机制；通过观察9NC和9NC-LP经静脉给药后对肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的抗肿瘤作用和对裸鼠体重、行为的影响，评估9NC-LP抗肿瘤效果和毒副作用，初步评价9NC-LP作为静脉用抗肿瘤药物的可能性。
　　 方法:
　　 1．试验中首先采用MTT法和BrdU法测定9NC和9NC-LP孵育不同时间后，肝癌细胞株HepG2、Bel-7402、Hep 3B、SMMC-7721和正常肝细胞株L02细胞活力及细胞增殖力改变。并利用SPSS 13.0计算药物的IC50，比较9NC和9NC-LP在各个时间点对细胞的抑制作用，并筛选下一步实验中使用的细胞株。
　　 2．9NC和9NC-LP孵育细胞后，PI对细胞进行染色，利用流式细胞仪测定细胞周期改变和SubG1峰（凋亡峰）；然后再用Annexin V-PE/7-AAD对细胞进行染色，流式细胞仪测定细胞的凋亡情况。
　　 3．通过在裸鼠背部皮下注射HepG2细胞，建立肝癌的裸鼠皮下瘤移植模型，经尾静脉给药后定期测量裸鼠的肿瘤体积变化，计算肿瘤生长抑制率；定期观察裸鼠的体重和行为改变，评价药物的毒副作用。
　　 4．在体外，9NC和9NC-LP孵育细胞后，提取细胞总蛋白，Western Blot测定细胞周期和凋亡蛋白表达变化；在体内，荷瘤鼠给药一段时间后处死裸鼠，切取肿瘤组织并提取蛋白，Western Blot测定细胞周期和凋亡蛋白表达变化。
　　 结果:
　　 1．9NC和9NC-LP在体外均可以抑制细胞生长，孵育24h后9NC和9NC-LP对细胞生长的抑制无明显差异，孵育48h和72h后9NC-LP对细胞生长的抑制强于9NC。9NC和9NC-LP对细胞生长的抑制呈现明显的时间和剂量依赖，细胞活力和细胞增殖力随着孵育时间延长和剂量增加逐渐下降；同时，药物对细胞生长的抑制呈现明显的细胞依赖性，抑制效果依次为HepG2> Bel-7402> SMMC-7721> L02> Hep3B。2．9NC和9NC-LP孵育后细胞周期出现明显改变，孵育24h后S期阻滞最为明显，孵育72h后G2/M期细胞显著增多。Sub-G1峰和Annexin V-PE/7-AAD 双染均提示9NC和9NC-LP孵育后细胞出现凋亡。药物孵育后细胞周期改变先于凋亡出现。9NC和9NC-LP对细胞周期和凋亡的调控呈现明显的细胞依赖性，调控效果依次为肝癌细胞> 正常肝细胞>p53缺陷的肝癌细胞。
　　 3．在体内，9NC和9NC-LP均表现出抑制肿瘤生长的作用，9NC-LP抗肿瘤效果强于9NC。9NC原料药在高、低剂量时均出现明显的体重下降和药物相关的裸鼠死亡；9NC-LP组裸鼠在高、低剂量时体重下降均明显弱于9NC组，且未出现药物相关裸鼠死亡。9NC高、低剂量组均引起动物死亡、腹泻、出血性膀胱炎等副作用，9NC-LP副作用较轻。
　　 4．体外，药物孵育后HepG2、L02细胞周期蛋白和凋亡蛋白出现显著的表达变化，蛋白表达变化支持细胞S期阻滞和凋亡，蛋白表达变化HepG2>L02，但p53缺陷的Hep3B细胞蛋白表达变化不明显。体内蛋白表达与体外一致，并呈现量效关系。
　　 结论和创新点:
　　 1．在国内首次采用卵磷脂材料构建用于9NC传递的脂质体纳米载药系统，同时将9NC的这种静脉用脂质体剂型进行了动物模型体内实验，并取得良好的效果。在体外、体内，与脂质体结合后9NC抗肿瘤效果增加，提示脂质体纳米载药系统可以提高9NC的抗肿瘤活性。9NC-LP对肿瘤的抑制呈现明显的时间和剂量依赖，提示9NC-LP符合化疗药物的药效学一般特征。研究在国内开拓了9NC纳米载药系统新的研究领域，在国际上较为先进。
　　 2．通过对9NC和9NC-LP体外、体内抗肿瘤机制的探讨，发现除了引起细胞周期阻滞之外，诱导凋亡也是9NC抗肿瘤的重要机制。进一步的研究显示死亡受体介导的凋亡和线粒体相关的凋亡都在9NC抗肿瘤过程中发挥了一定作用。此外，在p53缺陷的细胞中，9NC诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的能力明显下降，提示p53在9NC抗肿瘤过程中发挥着重要作用。这些发现进一步完善了9NC抗肿瘤机制理论。
　　 3．研究显示，经静脉注射空白卵磷脂脂质体后动物耐受良好，在实验剂量下未发现毒副作用，提示脂质体载体本身对机体并无毒性。经静脉注射后，与9NC原料药相比9NC-LP抗肿瘤作用增强，同时毒副作用显著下降。毒副作用的下降使得动物对药物的可耐受剂量增高，从而提高了给药剂量，这进一步增强了药物的抗肿瘤效果。这些发现提示新构建的纳米载药系统9NC-LP经静脉用药抗肿瘤效果显著，可能改变目前9NC无静脉制剂的现状。
　　 第一部分 9-硝基喜树碱脂质体对肝癌细胞活力及增殖力的影响
　　 目的：研究9NC-LP在体外对肝癌细胞株和正常肝细胞株细胞活力和增殖力的影响，初步判断与脂质体结合以后9NC 抗肿瘤活力，并筛选适合下一步实验使用的细胞株。
　　 方法：采用MTT 法和BrdU 法测定9NC和9NC-LP 孵育不同时间后，肝癌细胞株HepG2、Bel-7402、Hep 3B、SMMC-7721和正常肝细胞株L02细胞活力及细胞增殖力改变。并利用SPSS13.0 计算药物的IC50，比较9NC和9NC-LP在各个时间点对细胞的抑制作用。
　　 结果:
　　 1．9NC和9NC-LP在体外均可以抑制细胞生长，孵育24h后9NC和9NC-LP对细胞生长的抑制无明显差异，孵育48h和72h后9NC-LP对细胞生长的抑制强于9NC。
　　 2．9NC和9NC-LP对细胞生长的抑制呈现明显的细胞依赖性，抑制效果依次为HepG2> Bel-7402> SMMC-7721> L02> Hep3B。
　　 3．9NC和9NC-LP对细胞生长的抑制呈现明显的时间和剂量依赖，细胞活力和细胞增殖力随着孵育时间延长和剂量增加逐渐下降。
　　 结论:
　　 1.与脂质体结合后9NC在体外抗肿瘤能力增加，提示脂质体可以提高9NC的抗肿瘤活性。
　　 2．根据细胞对药物的敏感程度，下一步选用对药物比较敏感的肝癌细胞HepG2、Bel-7402，对药物不敏感的p53缺陷型肝癌细胞Hep3B和正常肝细胞L02探讨9NC-LP的抗肿瘤机制。
　　 3．9NC-LP对细胞生长的抑制呈现明显的时间和剂量依赖，提示9NC-LP符合化疗药物的药效学一般特征。
　　 第二部分 9-硝基喜树碱脂质体对肝癌细胞周期和凋亡的调控作用
　　 目的：研究9NC-LP在体外对肝癌细胞株和正常肝细胞株细胞周期和凋亡的影响，初步探讨初9NC-LP 抑制细胞生长的基本机制。
　　 方法：9NC和9NC-LP 孵育细胞一定时间以后，利用PI 对细胞进行染色，流式细胞仪测定细胞周期改变和细胞的凋亡情况；Annexin V-PE/7-AAD 对细胞进行染色，流式细胞仪测定细胞的凋亡情况。
　　 结果:
　　 1．9NC和9NC-LP孵育后细胞周期出现明显改变，孵育24h后S期阻滞最为明显，孵育72h后G2/M期细胞显著增多。Sub-G1峰和AnnexinV-PE/7-AAD双染均提示9NC和9NC-LP孵育后细胞出现凋亡。
　　 2．9NC和9NC-LP对细胞周期和凋亡的调控呈现明显的细胞依赖性，调控效果依次为HepG2> Bel-7402> L02> Hep3B。
　　 3．9NC和9NC-LP孵育后细胞周期改变早于凋亡。
　　 结论:
　　 1．9NC和9NC-LP可以显著的调控细胞周期，其中S期阻滞最为明显，长时间和高剂量孵育后细胞周期其他时相也出现明显改变。
　　 2．9NC和9NC-LP对细胞周期效果为依次为肝癌细胞>正常肝脏细胞>p53缺陷的肝癌细胞。
　　 3．细胞周期阻滞和凋亡均参与了9NC-LP抑制细胞生长的过程，其中周期阻滞先于凋亡出现且占主导地位。
　　 第三部分 9-硝基喜树碱脂质体对肝癌荷瘤鼠抗肿瘤作用及毒性研究
　　 目的：通过观察9NC-LP 对荷瘤鼠肿瘤生长的抑制作用和给药后动物的体重、行为改变，评价与脂质体结合前后9NC 体内抗肿瘤效果，并观察脂质体结合前后9NC 毒副作用改变。
　　 方法：建立肝癌的裸鼠皮下瘤移植模型，经尾静脉给药后定期测量裸鼠的肿瘤体积变化，计算肿瘤生长抑制率；定期观察裸鼠的体重和行为改变，评价药物的毒副作用。
　　 结果:
　　 1．在体内，9NC和9NC-LP均表现出抑制肿瘤生长的作用，9NC-LP抗肿瘤效果强于9NC。
　　 2．9NC组在高、低剂量时均出现明显的体重下降和药物相关的裸鼠死亡；
　　 9NC-LP组裸鼠在高、低剂量时体重下降均明显弱于9NC组，且未出现药物相关裸鼠死亡，与9NC组相比9NC-LP组毒副作用显著下降。
　　 结论:
　　 1．9NC和9NC-LP在体内可以显著的抑制肿瘤生长，并呈现出明显的剂量依赖关系。
　　 2．9NC-LP可以通过降低药物的毒副作用而提高给药剂量，从而提高抗肿瘤效果。
　　 3．静脉给药后9NC-LP未出现明显的毒副作用，是一种有前景的抗肿瘤药物。
　　 第四部分 9-硝基喜树碱脂质体抗肝癌机制探讨
　　 目的：通过测定体外、体内9NC-LP 干预后肝癌细胞株和正常肝细胞株细胞周期和凋亡蛋白表达变化，探讨9NC-LP 抗肝癌的机制。
　　 方法：在体外，9NC和9NC-LP 孵育细胞后，提取细胞总蛋白，Western Blot 测定细胞周期和凋亡蛋白表达变化；在体内，荷瘤鼠给药一段时间后处死裸鼠，切取肿瘤组织并提取蛋白，Western Blot 测定细胞周期和凋亡蛋白表达变化。
　　 结果:
　　 1．体外，药物孵育后HepG2、L02细胞周期蛋白和凋亡蛋白出现显著的表达变化，蛋白表达变化支持S 期阻滞和凋亡，蛋白表达变化HepG2>L02。但p53 缺陷的Hep3B细胞蛋白表达变化不明显。
　　 2．细胞周期蛋白表达变化强于凋亡相关蛋白的变化。
　　 3．体内蛋白表达与体外一致，并呈现量效关系。
　　 结论:
　　 1．9NC和9NC-LP 体外、体内均可以通过阻滞细胞周期和诱导凋亡发挥抗肿瘤作用。
　　 2．9NC和9NC-LP 干预后细胞周期阻滞较凋亡更加明显，提示阻滞细胞周期可能是9NC 抗肿瘤的主要机制，p53在这个过程中可能发挥重要作用。
　　 3.与脂质体结合前后9NC 抗肿瘤机制没有发生改变。

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论文说明:缩略词表

声明

引 言

第一部分 9-硝基喜树碱脂质体对肝癌细胞活力及增殖力的影响

第二部分 9-硝基喜树碱脂质体对肝癌细胞周期和凋亡的调控作用

第三部分 9-硝基喜树碱脂质体对肝癌荷瘤鼠抗肿瘤作用及毒性研究

第四部分 9-硝基喜树碱脂质体抗肝癌机制探讨

结 论

纳米载药系统抗肿瘤研究现状

参 考 文 献

附录 攻读学位期间发表论文目录

致 谢