来曲唑诱导大鼠多囊卵巢综合症模型的构建及相关microRNAs的筛选验证

摘要

第一部分:
　　 来曲唑诱导大鼠PCOS 动物模型的构建及基因芯片的制备筛选
　　 目的：1．采用来曲唑灌胃方法构建雌性Wistar 大鼠PCOS 动物模型，并分析比较模型组与对照组的血清睾酮（T），雌二醇（E2）和黄体生成素（LH）水平变化，胰岛素抵抗相关的特征及卵巢的形态学改变。
　　 2．利用基因芯片的技术筛选两组之间差异表达的microRNAs，探讨其参与PCOS 发生和发展过程中的可能机制。
　　 方法：1、选取6周龄清洁级的雌性Wistar 大鼠，随机分组为模型组和对照组，每组各20只。PCOS模型组：每日来曲唑1 mg/（kg·d)溶于1％的羧甲基纤维素(CMC)中,连续灌服21 d；对照组：不予处理，正常喂养。从用药的第10天开始每日进行阴道涂片至用药期结束，在最后一次应用来曲唑24h(并禁食12h)后，同时在处理对照组大鼠时，尽量控制其在动情间期。水合氯醛麻醉后切取卵巢，心脏取血，分离血清。全自动化学发光检测仪测定血清T，E2和LH；放射免疫学方法测定空腹血清胰岛素（FINS），血糖仪测定空腹血糖（FBG），并计算胰岛素抵抗指数（HOMA1-IR）；称重卵巢并测定大鼠体重；卵巢组织切片，HE 染色，并观察其病理变化。
　　 2．从造模成功的PCOS模型组及正常对照组中各随机选取3只大鼠，10％的水合氯醛腹腔麻醉后，心脏取血后迅速取出双侧卵巢，称重后将其中的一个卵巢液氮冷冻固定保存，送往北京博奥生物有限公司应用最新版本15.0的LC-science microRNAs表达谱微阵列芯片进行筛选microRNAs。
　　 结果：
　　 1.阴道涂片结果显示模型组无明显的动情周期的改变，大多处于动情间期，而对照组则有明显的动情周期的变化。模型组卵巢切片HE 染色显示：卵巢有较多的囊状扩张卵泡，而黄体及发育阶段卵泡数目明显减少，卵泡内卵母细胞和放射冠消失，颗粒细胞层数减少或消失，卵泡膜细胞及间质细胞增生。对照组可见多个黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡内颗粒细胞呈多层，多为8-9 层。
　　 2．与对照组比较，PCOS模型组血清T 显著高于对照组（P<0.01），而血清FBG，FINS和HOMA1-IR 无统计学差异（均为P>0.05），两组大鼠体重变化无统计学差异（P>0.05），去除体重影响后PCOS模型组大鼠卵巢重量显著大于对照组（P<0.05）。
　　 3.基因芯片结果表明，对照组与模型组两组的卵巢之间大量有差异表达的microRNAs。与对照组比较，在模型组表达明显增多有57个microRNAs(P<0.01)其中有23个信号值较高差异较明显，34个是信号值低于500 但是也有差异的；表达明显减少的有43个microRNAs(P<0.01)，其中20个信号值较高差异显著，23个是信号值低于500 差异也显著的，包括差异较大、且有证实意义的、与细胞增殖凋亡相关的mir-16，mir-21，mir-24，mir-31，mir-98，mir-125b，mir-143,mir-145，mir-150等。
　　 结论：
　　 1．来曲唑诱导雌性Wistar 大鼠PCOS 动物模型的卵巢病理改变及血内分泌改变与PCOS 病人相似。阴道图片也显示出模型组无明显的排卵周期的变化，这些改变类似于PCOS 患者的病理生理变化，但是此种模型无胰岛素抵抗相关的改变征象。可以作为研究非胰岛素抵抗型PCOS的动物模型。
　　 2．模型组与正常组之间存在大量表达差异的microRNAs，说明microRNAs可能在PCOS 疾病的发生发展中有着重要的作用，可以为研究PCOS 疾病的病理机制提供新的方向和线索，及进一步验证相关microRNAs 有重要的参考价值。
　　 第二部分:大鼠PCOS动物模型中mir-21和mir-320 含量表达的验证
　　 目的：结合文献报道与基因芯片筛选结果，选择mir-21和mir-320进行验证，观察它们在PCOS模型组与正常组之间的表达差异，并探讨其在PCOS疾病的发生发展中的可能机制。
　　 方法：采用实时荧光定量PCR检测两组大鼠卵巢中mir-21和mir-320的表达水平，选择snRNA U6 为内参照miRNA，每份标本均设2个平行复孔和1个阴性对照。
　　 结果：荧光定量PCR结果分析显示模型组的mir-21的表达量相对对照组的表达量约是0.48，而mir-320在两组之间的含量相当，无明显的差别。
　　 结论：从real-timePCR验证的结果我们得知，mir-21和mir-320在两组中的含量变化与基因芯片结果相符合。因此可以推测PCOS 患者中卵泡的发育成熟障碍可能与mir-21的含量减少有关。Mir-320是与胰岛素抵抗发病有关的一种microRNA，而在我们的结果中证明了其在两组中的含量是相当的，所以进一步证明了来曲唑诱导的PCOS 动物模型是没有胰岛素抵抗特点的，这点是与雄激素造模法的不同之处。

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前 言

第一部分 来曲唑诱导的大鼠PCOS动物模型的构建及基因芯片的制备筛

第二部分 大鼠PCOS动物模型中mir-21和mir-320 含量表达的验证

参考文献

综述 microRNAs 及其在多囊卵巢综合症中的研究进展

致谢