营养诱导舍饲绵羊非繁殖季节发情相关microRNA筛选及其靶基因功能验证

摘要

绵羊是典型的季节性发情动物，其发情的季节性特点一直是制约绵羊生产繁殖效率的瓶颈。目前，针对绵羊季节性发情调控机制的研究主要集中在光通路调控方面，现普遍认为绵羊的季节性发情主要受光通路的调控，并初步确定了其繁殖活动的光通路季节性发情调控模式图。但在实际生产中发现，除了日照、温度等因素影响绵羊的季节性发情外，高营养水平饲喂的哈萨克羊在非繁殖(乏情）季节也可以表现出发情的现象，研究这一营养水平的改变如何调控非繁殖季节绵羊发情活动，对提高绵羊生产繁殖效率具有重要的指导意义；为此本研究开展了营养诱导舍饲绵羊在非繁殖季节条件下，发情相关microRNA筛选及其靶基因功能验证实验，具体内容如下：
　　目的：在不同营养水平处理绵羊中，通过筛选差异表达的microRNA，用生物信息学分析方法推测其靶基因，分析靶基因在光通路或其它通路的作用，建立营养调控发情的信号通路。
　　方法：⑴构建不同营养水平哈萨克羊群，在乏情期对试验绵羊发情情况观察记录。⑵乏情季节，前后分别屠宰3只发情(EN)和乏情母羊(AN)，分别采集下丘脑(H)、垂体(P)和卵巢(O)，共构建6个miRNA文库，并进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR检测部分miRNA相对表达量，验证建库的可靠性。对差异表达中出现频率较高的miR-200a/b/c进行组织表达谱分析。⑶细胞水平验证实验。?通过双荧光素酶报告基因系统，验证 miR-200b对靶基因GNAQ的真实干扰作用。?miR-200b干扰载体转染下丘脑神经细胞，选择GNAQ下游基因ITPR，PRKCB，GNA1，CREB，MAP3K1,GPR54，KISS1及GnRH进行实时荧光定量检测。?miR-200b干扰载体转染卵巢颗粒细胞，选择GNAQ下游基因COMT，HSD3B1,CYP1A1和PKA基因进行表达量验证。
　　结果：①高营养实验组发情率明显高于对照组。②下丘脑（HEN vs HAN）两文库相比，有8个已知和140个未知miRNA表达差异显著。?垂体（PEN vs PAN）两文库相比，有14个已知和104个未知miRNA表达差异显著。?卵巢（OEN vs OAN）两文库比较发现，有9个已知和104个未知miRNA表达差异显著。通过软件预测出靶基因并进行GO分析发现，以上文库涉及细胞过程、发育过程、生长过程、代谢过程、生物调节过程、细胞融合、催化活性、繁殖过程和酶调节活性过程等。对其调控通路进行KEGG分析，发现有MAPK信号通路(钟基因相关通路)，GnRH信号通路（发情激素相关），胰岛素信号通路，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和甘油磷脂代谢通路等。通过部分miRNA的实时荧光定量PCR结果验证了建库的可靠性。对哈萨克羊miR-200a/b/c进行组织表达谱分析，结果发现miR-200a/b/c在生殖系统垂体、子宫和输卵管中表达量较高。③以荧光素酶表达结果显示：共转染GNAQ-3’UTR-psi-CHECKTM-2和pri-miR-200b-pcDNA3.1(+)的hela细胞组是只转染psi-CHECKTM-2的hela细胞组荧光素酶值的77.5％；其余两组与只转染psiCHECKTM-2的hela细胞组之间的差异没有统计学意义。④下丘脑细胞转染实验结果发现，miR-200b干扰组和对照组相比，GNAQ基因显著下调，下游ITPR，PRKCB，GNA1和MAP3K1，发情关键基因GPR54，KISS1和GnRH显著上调。⑤卵巢颗粒细胞转染结果发现，miR-200b干扰后，GNAQ基因表达量升高，下游基因COMT，HSD3B1,CYP1A1和PKA表达量下降。
　　结论：⑴通过靶基因及相关发情通路分析，总结出从酪氨酸和叶酸两种营养物质出发，有别于光周期调控发情的通路：以PI3K基因为中心，下游通过PI3K-AKT通路作用于MEK1基因，或者通过白细胞跨内皮迁移通路作用于MMP14基因，继而作用于MEK1基因，MEK1基因通过GnRH通路作用于FSH和LH。MEK1还可以通过FcγR-介导吞噬通路作用于PLA2G4A，再通过卵巢类固醇合成通路作用于ALOX5进而影响雌二醇和瘦素的分泌。PI3K基因上游，Rap1通过白细胞跨内皮迁移通路作用于PI3K，多巴胺受体基因通过Rap1信号通路作用于Rap1，多巴胺通过多巴胺突触通路作用于多巴胺受体，其上游受到酪氨酸的调控。至此建立一条从酪氨酸出发的营养调控发情的通路，和光调控发情的通路有所不同。另外，叶酸可以通过内吞作用通路作用于SMAD7，继而作用于下游的SMAD2/3，SMAD2/3通过作用于SMAD4促进雌二醇产生进而影响发情。以上通路的探讨为完善非季节性营养调控绵羊发情网络奠定基础。⑵通过细胞水平验证试验发现miR-200b真实靶向调控GNAQ基因，并可能通过靶向作用GNAQ基因调控发情过程。

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前言

第一章 文献综述

1 绵羊的季节性发情内分泌调节

2光周期对季节繁殖的作用机制

3 下丘脑-垂体-卵巢性腺（HPG）轴发情相关microRNAs的研究现状

4 营养对季节性繁殖的调控机制

5 本研究目的与意义

第二章 不同营养水平饲喂羊群的构建

1材料和方法

2 结果

3 讨论

第三章 非繁殖季节发情与乏情哈萨克羊下丘脑、垂体、卵巢差异miRNA鉴定

1材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第四章oar-miR-200b对GNAQ基因的表达调控

1材料与方法

2 实验结果

3讨论

全文总结

本文创新点及展望

创新

展望

附录

参考文献

作者简介

致谢

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