EGFR信号通路通过 Egr2促进骨祖细胞增殖并抑制骨祖细胞凋亡的实验性研究

摘要

骨组织结构完整性的维持依赖于骨祖细胞池中成骨细胞的不断更新,该生物学过程由许多生长因子进行精细调控。表皮生长因子受体(EGFR)配体是目前已知的骨祖细胞有丝分裂原。但这些配体调节骨祖细胞池的具体机制没有得到详细阐述,尤其是EGFR信号通路在调节骨祖细胞凋亡中的作用没有得到详细研究。在本研究中,证实了EGFR信号通路的激活通过促进骨祖细胞增殖并抑制骨祖细胞凋亡,增加骨祖细胞数量。该结论在大鼠颅骨组织器官培养实验中得到进一步证实。在大鼠颅骨组织器官培养实验中,表皮生长因子(EGF)在增加增殖细胞数量的同时,降低了凋亡细胞数量,从而增加成骨细胞总数量。骨祖细胞系 MC3T3细胞 Microarray分析提示,EGFR信号通路能诱导抗凋亡基因 Mcl1以及早期生长反应基因(Egr1,Egr2,Egr3)的表达。过表达 Egrs的抑制蛋白 Nab2可抑制EGF诱导的骨祖细胞数量增加。进一步实验表明,以 SiRNA降低 Egr2的表达,可抑制EGF诱导的骨祖细胞数量增加,而以 SiRNA降低 Egr1、Egr3的表达,则对 EGF诱导的骨祖细胞数量增加没有影响。进一步研究证实 Egr2是 EGF促进骨祖细胞增殖并抑制骨祖细胞凋亡的主要介导基因。采用腺病毒过表达、抑制剂以及SiRNA等实验方法,我们证实了EGFR信号通路激活 MAPK/Erk通路,进而诱导 Egr2的表达,从而导致了Mcl1的增加,最终抑制细胞凋亡。同时,另一骨祖细胞有丝分裂原和存活因子成纤维细胞生长因子(FGF)2,也能通过诱导 Egr2的表达,进而促进骨祖细胞增殖,抑制骨祖细胞凋亡。这些结果表明,Egr2在生长因子介导的骨祖细胞数量增加中起着重要作用。总的来说,实验结果清楚地说明了EGFR信号传导通路,通过诱导 Egr2的表达,促进骨祖细胞增殖,抑制骨祖细胞凋亡,进而在调节骨祖细胞库的生物学功能中,起着重要的作用。
　　本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 EGFR信号通路促进骨祖细胞增殖并抑制骨祖细胞凋亡
　　目的:检测 EGFR信号通路对骨祖细胞增殖和凋亡的影响。
　　方法:将成骨细胞系MC3T3细胞或大鼠原代颅骨成骨细胞培养于含0.5％FBS培养基内,分别给予EGFR配体(实验组)或等体积EGFR配体溶解液(对照组),以细胞计数法连续检测MC3T3细胞总数。同时,以BrdU法检测MC3T3细胞或大鼠原代颅骨成骨细胞在实验组和对照组中的增殖情况,并以EB/AO染色法检测在血清剥夺及TNFα诱导时,这两组中MC3T3细胞或大鼠原代颅骨成骨细胞的细胞凋亡情况。同时,分别以EGFR特异性抑制剂吉非替尼(Gefitinib,GEF)、MEK1/2信号传导途径特异性抑制剂U0126、PI3K信号传导途径特异性抑制剂喔曼青霉素(Wortmannin,WM)以及p38信号传导途径抑制剂SB预处理细胞,初步探讨EGFR信号通路影响骨祖细胞增殖和凋亡的机制。与此同时,取第五代骨祖细胞/成骨细胞特异性EGFR敲除小鼠(3.6kb collagen1a1-Cre EgfrWa5/flox小鼠)及其野生型同科小鼠原代骨髓间质干细胞,以流式细胞学(Flow Cytometry)分析其细胞特性,并以EB/AO染色法检测EGF对血清剥夺或TNFα诱导的骨髓间质干细胞凋亡的影响。
　　结果:细胞计数法结果显示,与对照组相比,实验组中MC3T3细胞或大鼠原代颅骨成骨细胞总数明显增加。BrdU法检测显示,实验组中增殖 MC3T3细胞或大鼠原代颅骨成骨细胞的数量显著高于对照组。同时,EB/AO染色法结果显示,实验组中血清剥夺或 TNFα诱导的MC3T3细胞或大鼠原代颅骨成骨细胞凋亡细胞数量较对照组显著减少。抑制剂实验显示,EGF促进细胞增殖依赖于 MAPK/Erk和PI3K/Akt两条信号传导途径,而EGF抑制血清剥夺或 TNFα诱导的MC3T3细胞或大鼠原代颅骨成骨细胞凋亡仅依赖于 MAPK/Erk信号传导途径而不依赖于 PI3K/Akt信号传导途径。流式细胞学分析显示,第五代骨祖细胞/成骨细胞特异性 EGFR敲除小鼠(3.6kb collagen1a1-Cre EgfrWa5/flox小鼠)及其野生型同科小鼠原代骨髓间质干细胞细胞表面表达有干细胞标志物(Sca1+CD29+CD45-)。EB/AO染色显示,在野生型小鼠原代骨髓间质干细胞中,EGF对血清剥夺或 TNFα诱导的细胞凋亡有抑制作用,而在骨祖细胞/成骨细胞特异性 EGFR敲除小鼠骨髓间质干细胞中,EGF对血清剥夺或 TNFα诱导的细胞凋亡没有影响。
　　结论:EGFR信号通路可以促进骨祖细胞增殖,抑制骨祖细胞凋亡。其促进骨祖细胞增殖机制依赖于 MAPK/Erk和PI3K/Akt两条信号传导途径,而抑制骨祖细胞凋亡机制仅依赖于 MAPK/Erk信号传导途径。
　　第二部分 EGFR信号通路促进颅盖骨组织器官内成骨细胞系细胞增殖并抑制其凋亡
　　目的:探讨 EGFR对颅盖骨组织器官内成骨细胞系细胞增殖和凋亡的影响。
　　方法:将新生小鼠颅盖骨组织器官分别于含有10％FBS的生长培养基(FBS组)、含或等体积EGF溶剂(1mg/ml BSA in1 mM Acetic Acid)无FBS生长培养基(对照组)和含有50ng/ml EGF的无FBS生长培养基(实验组)内培养7天。经脱钙处理后,将标本进行石蜡包埋并切片。行苏木精伊红(Hematoxylin&Eosin, H&E)染色,检测器内成骨细胞数量。同时,行Ki67、TUNEL、TRAP免疫组化染色,以检测组织内增殖细胞、凋亡细胞以及破骨细胞数量。
　　结果:培养7天后,在FBS组中,颅盖骨组织器官可见较多成骨细胞,且颅盖骨形态良好。在对照组中,可见颅盖骨组织器官中的成骨细胞数量明显减少,颅盖骨厚度变薄,形态较差。在EGF组内,可见大量成骨细胞,其成骨细胞含量甚至高于FBS组,且该处理组颅盖骨较厚,形态良好。EGF组中成骨细胞数量与对照组相比,有明显差异。Ki67免疫组化染色显示,EGF组内,颅盖骨组织的增殖细胞数显著高于对照组组。同时,TUNEL免疫组化染色结果显示,EGF能显著降低颅盖骨组织中凋亡细胞的数量。此外,破骨细胞TRAP染色提示,EGF还可维持颅盖骨组织中破骨细胞数量。
　　结论:在颅盖骨组织器官培养中,EGFR信号通路可以促进成骨细胞增殖,抑制其凋亡,同时,对维持破骨细胞数量也有重要作用。
　　第三部分 EGFR信号通路通过 MAPK/Erk/Egr2信号传导途径介导凋亡
　　目的:探讨 EGF促进骨祖细胞增殖并抑制骨祖细胞凋亡的具体机制。
　　方法:以50ng/ml EGF刺激 MC3T3细胞,并收集1小时、4小时和24小时 RNA标本进行微阵列分析(Microarray Analysis),寻找 EGF调节的凋亡相关基因以及EGF上调最多的基因。再以 qRT-PCR,Western Blotting检测这些基因的mRNA及蛋白表达。同时,应用SiRNA技术以及腺病毒过表达技术,研究这些基因在骨祖细胞内的生物学效应。
　　结果:微阵列分析显示,Mcl1是唯一受 EGF调节的凋亡相关基因。EGF可诱导 Mcl1 mRNA水平和蛋白水平的表达。该表达可被 EGFR特异性抑制剂吉非替尼(Gefitinib, GEF)和MAPK/Erk信号传导途径特异性抑制剂 U0126所抑制。EGR1,2和3是 EGF刺激后骨祖细胞内 mRNA水平表达增强的一组即早反应基因。EGF可诱导 EGRs mRNA水平和蛋白水平的表达,其表达峰值在30分钟至1小时。EGF诱导 EGRs表达也可被 EGFR特异性抑制剂吉非替尼(Gefitinib)和MAPK/Erk信号传导途径特异性抑制剂 U0126所抑制。过表达 Egrs转录共抑制因子 Nab2或以 SiRNA降低 Egr2活性,可抑制EGF对骨祖细胞的促增殖和抑制凋亡的作用。同时,降低 Egr2活性,抑制了FGF2对骨祖细胞的促增殖和抑制凋亡的作用。
　　结论:EGFR信号通路通过 MAPK/Erk/Egr2信号传导途径介导细胞增殖和抑制细胞凋亡。EGR2介导 EGFR在维持骨祖细胞池稳态中的作用。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

第一部分EGFR信号通路促进骨祖细胞增殖并抑制骨祖细胞凋亡

中文摘要

英文摘要

前 言

材料与方法

统计学分析

结 果

讨 论

结 论

参考文献

第二部分 EGFR信号通路促进颅盖骨组织器官内成骨细胞系细胞增殖并抑制其凋亡

中文摘要

英文摘要

前 言

材料与方法

统计学分析

结 果

讨 论

结 论

参考文献

第三部分 EGFR信号通路通过MAPK/Erk/Egr2信号传导途径介导凋亡

中文摘要

英文摘要

前 言

材料与方法

统计学分析

结 果

讨 论

结 论

参考文献

EGFR信号网络在骨组织生物学及病理学中的作用

EGFR信号网络在骨组织生物学中的作用

EGFR信号网络概况

EGFR信号传导与生长板

EGFR信号网络在成骨细胞性成骨中的作用

EGFR信号网络在介导PTH促进骨组织合成代谢中的作用

EGFR信号网络与骨髓间质干细胞

EGFR对破骨细胞的作用：直接或间接？

EGFR/IGFI-R相互作用

EGFR在骨恶性肿瘤及骨转移癌中的作用

总结

参考文献

附 录

致谢