Wnt2B细胞信号传导通路与肿瘤发生发展的关系和机制的研究

摘要

Wnt基因的名称取自果蝇极性基因 Wingless和小鼠癌基因 Int-1。Wnt基因的胞外端信号传导系统在果蝇到人类的各种生物种普遍存在,并且是极少数在生物进化过程中高度保守的信号传导系统。Wnt家族由一系列分泌性的蛋白构成,具有广泛的生物功能,如细胞生成、生长、分化及器官形成等。现在一共发现有19中WNT基因,有一部分还拥有多种剪接变异体。根据 Wnt蛋白在细胞或动物体内作用的模式可以分为经典和非经典 Wnt蛋白两类。
　　由于 Wnt可以调控细胞的存活、增殖和运动而在胚胎发育领域备受关注。后来发现 Wnt/catenin通路由于可以调控细胞增殖而与一系列疾病的发生发展密切相关,包括肿瘤的发生发展,如结肠癌、骨肉瘤、肝源性肿瘤,卵巢肿瘤、乳腺肿瘤和前列腺肿瘤。大量研究均提示 Wnt在肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用。
　　Wnt2B/Wnt13是第13个被克隆出的人 Wnt基因,后来发现此基因在小鼠、鸡和斑马鱼上都高度保守。人类的Wnt2B与 Wnt2在基因序列有66.9％的相似,而小鼠则有71.1％的相似性。Wnt2B可以通过经典 Wnt通路与 Frizzled受体相作用,也可以通过非经典 Wnt通路作用于钙离子通道。研究发现 Wnt2B不仅在胚胎的脑,肺,肾,成人的心脏,脑,胎盘,肺,前列腺,卵巢,直肠等正常组织表达,而且在多种人类肿瘤例如胃癌,基底细胞癌,乳腺癌,头颈肿瘤,宫颈癌和白血病均有表达。Wnt2B在肿瘤的高表达提示此基因可能与肿瘤的发生发展相关,但是其中的机制并不清楚。
　　本研究以卵巢癌细胞系A2780、C13K和乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231为研究对象,探讨Wnt2B信号通路在卵巢癌侵袭转移及耐药中的作用及可能机制和乳腺癌侵袭转移中的作用机制,对阐明卵巢癌和乳腺癌恶性表型的发生机制和锚定以Wnt2B基因作为治疗卵巢癌和乳腺癌的新靶点提供实验依据。
　　第一部分 Wnt2B对卵巢癌细胞侵袭转移和耐药逆转作用的研究
　　目的：
　　在多种肿瘤的发生发展中均存在着Wnt2B的过表达现象。Wnt2B主要通过经典WNT通路发生作用,然而Wnt2B在肿瘤发生发展中的作用机制不甚清晰。本研究通过应用siRNA技术沉默Wnt2B的表达,发现可以抑制卵巢癌细胞的侵袭转移能力和提高卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。
　　方法：
　　本实验中采用了SKOV3, OV2008, A2780和C13K四株卵巢癌细胞系,并且采用Western blotting方法检测了Wnt2B的蛋白表达水平。克隆形成能力和侵袭能力分别采用克隆形成实验和Matrigel胶transwell小室进行检测。细胞存活率采用MTT检测,而细胞的凋亡率则采用细胞流式术进行检测。
　　结果：
　　1、Western blot检测结果显示在SKOV3, OV2008, A2780和C13K细胞中,A2780和C13K细胞Wnt2B的蛋白的表达水平明显高于SKOV3和OV2008细胞( P<0.05);由于本实验采用siRNA基因沉默技术研究Wnt2B的分子机制,因此采用A2780和C13K细胞系作为细胞的模型。
　　2、克隆形成实验和Transwell实验结果显示,下调Wnt2B可以明显抑制细胞的克隆形成能力和细胞的侵袭能力。MTT结果显示,随着泰素浓度呈梯度增加,沉默Wnt2B的A2780细胞的存活率明显降低;同时顺铂浓度呈梯度增加,沉默Wnt2B的C13K细胞抑制率也呈现上升趋势,二者均存在良好的量效关系;流式细胞仪检测凋亡率显示,随着泰素浓度的增加,随着Wnt2B的表达下降,A2780细胞凋亡率明显高于对照组;同时,在顺铂作用下,沉默Wnt2B的C13K细胞凋亡率也明显升高于( P<0.05),且随着药物浓度的升高,处理组细胞与未处理组的细胞凋亡率的差异越明显。
　　3、 Western blot显示沉默 Wnt2B后, caspase-9/BCL2/BCL-xL和epithelial–mesenchymal transition(EMT)/phosphorylated AKT(p-AKT)通路均受到了明显的抑制。
　　结论：
　　Wnt2B基因在卵巢癌耐药细胞系中表达明显高于其他卵巢癌细胞系,通过实验表明Wnt2B同时与卵巢癌的侵袭转移和卵巢癌耐药密切相关,这可能提示Wnt2B可能是一个卵巢治疗的比较理想的靶点。
　　第二部分 Wnt2B对乳腺癌细胞侵袭转移作用和机制的研究
　　目的：
　　通过体外实验探讨Wnt2B在乳腺癌发生发展中的作用。
　　方法：
　　1、应用免疫组织化学的方法检测正常乳腺组织和乳腺癌组织中Wnt2B的表达;
　　2、采用RNA干扰技术,在MCF7细胞中沉默Wnt2B的表达,并经Western blot检测其沉默效率;
　　3、应用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测、观察Wnt2B沉默后对MCF7细胞凋亡、细胞骨架构成的改变。同时在蛋白水平上检测沉默Wnt2B后对细胞P53/P21通路的影响。
　　结果：
　　1、免疫组化检测结果显示,Wnt2B蛋白在乳腺癌中的表达率为88％明显高于正常乳腺组织10％。三对Wnt2B siRNA转染MCF7细胞后,Wnt2B均表达明显下调,以第二对siRNA(2号siRNA)沉默效果最为明显,相对于转染阴性对照siRNA其表达率为(13±5)％,差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　2、采用2号siRNA转染MCF748小时后细胞凋早期凋亡率和晚期凋亡率相对于对照细胞均明显增高,差异均具有统计学意义(P<0.05);
　　3、2号siRNA转染细胞早期凋亡率为(4.99±0.78)％,晚期凋亡率为(29.39±2.11)％;对照细胞早期凋亡率为(1.21±0.11)％,晚期凋亡率为(2.82±0.45)％。
　　4、2号siRNA转染MCF748小时后细胞骨架发生明显改变,表现为细胞骨架溶解,正常形态消失。
　　5、2号siRNA转染MCF748小时后细胞内P53及P21表达明显下降,表达率分别为(11.57±0.17)％和(2.45±0.91)％,相对于对照细胞中P53及P21表达(表达率分别为(35.21±1.89)％和(15.97±3.65)％)差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:
　　Wnt2B基因可以改变乳腺癌细胞的凋亡水平和骨架结构,在乳腺癌的发生发展中起着重要的作用,为乳腺癌的治疗提供了新的靶点。
　　第三部分 Wnt2B对乳腺癌细胞凋亡作用和机制的的研究
　　目的:
　　肿瘤来源于自身的细胞,细胞的新生和死亡在正常情况下处于一个平衡状态,当这个平衡状态被打破的时候即机体失去了对细胞的调控就产生了肿瘤。已有研究证实在乳腺癌的发生发展过程中,Wnt2B扮演着非常重要的角色,但其中的分子机制尚不明确,尤其是有关细胞凋亡方面。在本研究中,应用siRNA干扰技术我们发现该基因与乳腺癌的发生发展密切相关,可能是通过NF-κB途径调节细胞的凋亡过程。
　　方法:
　　1、应用免疫组织化学的方法检测正常乳腺组织和乳腺癌组织中Wnt2B的表达;
　　2、应用Western blot检测MCF7和MDA-MB-231的Wnt2B的表达;
　　3、采用RNA干扰技术,在MDA-MB-231细胞中沉默Wnt2B的表达,并经Western blot检测其沉默效率;
　　4、应用流式细胞术检测、Wnt2B沉默后对MDA-MB-231细胞凋亡、细胞骨架构成的改变;
　　5、采用凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测NF-κB/p65的激活情况;
　　结果:
　　1、我们应用免疫组化技术检测了40例乳腺癌组织标本中Wnt2B的表达,结果发现有35例乳腺癌组织的表达呈强阳性,同时我们在阳性组织中观察到一个核浆转移现象;
　　2、我们在乳腺癌配对细胞系MDA-MB-231和MCF7中检测Wnt2B的表达,发现在高转移细胞系MDA-MB-231中Wnt2B表达明显高于低转移细胞系MCF7。我们选择在MDA-MB-231细胞中转染Wnt2B siRNA48小时后发现细胞凋亡明显增加;
　　3、Wnt2B的表达下调同时还伴随着NF-κB/p65的表达下降和活性降低。
　　4、NF-κB/p65下游与凋亡密切相关的基因caspase3和caspase9表达也明显的降低;
　　5、我们应用NF-κB/p65特异性的抑制剂PDTC阻断此通路后,发现Wnt2B siRNA不能再继续诱导细胞的凋亡以及caspase3和caspase9表达的改变。
　　结论:
　　Wnt2B通过 NF-κB/p65途径调控乳腺癌细胞的凋亡,这提示 Wnt2B可能通过调控乳腺癌的凋亡来调节乳腺癌的发生发展。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前 言

参考文献

第一部分Wnt2B对卵巢癌细胞侵袭转移和耐药逆转作用的研究

中文摘要

英文摘要

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分Wnt2B 对乳腺癌细胞侵袭转移作用和机制的研究

中文摘要

英文摘要

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分Wnt2B对乳腺癌细胞凋亡作用和机制的的研究

中文摘要

英文摘要

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

综 述

摘要

1. WNT2B的结构和功能

2.WNT2B在肿瘤中的表达

3.WNT2B的调节肿瘤发生的分子机制

参考文献

English paper

致谢