毕赤酵母高密度发酵生产白地霉脂肪酶研究

摘要

白地霉脂肪酶(Geotrichum candidum lipase，GCL)对具有C9位顺式双键的长链不饱和脂肪酸具有高度底物特异性，基于这一性质可选择性地水解脂肪酸而富集高营养价值的多不饱和脂肪酸或选择性酯化分离共轭亚油酸异构体，应用潜力巨大。本文对含有GCL B基因的重组毕赤酵母(Pichia pastoris)Mut+表型和Muts表型工程菌进行了摇瓶发酵条件优化及10-L发酵罐高密度发酵产酶条件优化。主要研究结果如下：
　　（1）将实验室构建的X-33/pPICZα-gcl57＃进行罗丹明B平板检测及摇瓶发酵酶活验证，其初始酶活力为140 U/mL(橄榄油乳化液,碱式滴定法)。对该菌株的摇瓶发酵条件进行了优化，其最佳产酶条件为装液量40 mL/500 mL三角瓶、pH7.0、诱导时间72h、甲醇添加量1％，优化后酶活力达到375 U/mL。对57#重组子进行了10-L发酵罐高密度发酵条件优化研究，其最佳诱导产酶条件为：细胞生长阶段温度29.0°C、pH5.0，诱导阶段温度27.0°C、pH6.0。最佳条件下发酵162.8h，生物量达到338 g/L，蛋白含量达到2.68 g/L，酶活力达到5,000 U/mL，酶活生产率达到30.69 U/(mL·h)。采用甲醇与甘油混合补料，发酵139.8h生物量达到398 g/L，蛋白含量达到2.56 g/L，酶活力达到5,600 U/mL，酶活生产率达到40.06 U/(mL·h)，相对甲醇单独补料酶活提高16.7%，酶活生产率提高46.0%；而采用甲醇与山梨醇混合补料，发酵123h生物量达到395 g/L，蛋白含量达到2.74 g/L，酶活力达到6,000 U/mL，酶活生产率达到48.78 U/(mL·h)，相对甲醇单独补料酶活提高25.0%，酶活生产率提高78.2%。
　　（2）通过电转将载体pPICZα-gcl整合至P. pastoris KM71H中，得到一株酶活力最高达215 U/mL的Muts表型33#重组子，其摇瓶诱导产酶最佳甲醇添加量为0.6%。对其进行10-L发酵罐高密度发酵，甲醇单独诱导发酵196.7h，生物量达到332 g/L，蛋白含量达到2.61 g/L，酶活力达到5,450 U/mL，酶活生产率达到27.69 U/(mL·h)。采用甲醇与山梨醇混合补料发酵168.3h，生物量达到394 g/L，蛋白含量达到3.06g/L，酶活力达到6,500 U/mL，酶活生产率达到38.62 U/(mL·h)。
　　（3）将实验室构建的双启动子重组菌GS115/9Kgcl-FLDgcl26#进行10-L发酵罐混合碳源补料发酵研究。以甲醇和山梨醇作为混合碳源进行诱导，发酵113.1h，生物量达到396 g/L，蛋白含量达到4.52 g/L，酶活力达到11,200 U/mL，酶活生产率达到98.98 U/(mL·h)。
　　（4）对比三株工程菌在10-L发酵罐中的发酵特性及产酶情况，结论为：Muts型参数变化较 Mut+型更稳定；甲醇与山梨醇混合补料可以明显减少色素（FAD）的产生；采用甲醇与山梨醇混合补料相对甲醇单独补料，酶活力提高20%，酶活生产率提高30%~60%；而采用分子手段构建的双启动子工程菌，其酶活相对单一启动子工程菌提高约1倍，酶活生产率也提高1倍左右。

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1 文献综述

1.1 脂肪酶概述及应用

1.2 毕赤酵母表达系统研究进展

1.3 毕赤酵母高密度发酵研究进展

1.4 白地霉脂肪酶GCL及其研究进展

1.5 本课题研究的目的及意义

2 Mut+型工程菌摇瓶及10-L发酵罐发酵条件优化

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

3 Muts型工程菌的构建和10-L发酵罐高密度发酵

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

4 双启动子工程菌在10-L发酵罐中的高密度发酵

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

5 全文总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间发表论文目录

附录2 各种仪器和设备