反义抑制PCR检测结核杆菌耐利福平变异菌株方法以及临床应用的研究

摘要

结核分枝杆菌(Mycobacterium Tu berculosis,MTB),是由德国科学家Koch于1882年发现,并证明其为结核病的病原体。随着卫生状况的改善以及抗结核药物的不断发展,曾令结核病的发病率和病死率大幅度下降,然而80年代后,由于艾滋病(AIDS)的流行使结核病再度活跃。近年来,结核病的疫情呈现复苏的趋势,俨然成为传染病中的头号杀手和首要死亡病因。
　　利福平(RFP)是通过特异地与RNA聚合酶β亚基结合,从而抑制RNA聚合酶活性,并干扰分枝杆菌RNA的转录及合成,最终阻碍蛋白质合成来发挥抗菌作用的。研究表明,90％以上结核杆菌耐RFP都是由于其作用的靶分子RNA多聚酶β亚单位的编码基因(rpoB)发生突变所致。
　　目前检测结核分枝杆菌主要依靠涂片、培养加药敏、PCR技术等多项传统试验进行综合分析,其操作复杂、耗时长,敏感以及特异性差,易导致误诊和漏诊的发生,延误治疗的同时又加重了病人额外的经济负担。
　　本实验采用反义抑制PCR的方法,检测结核杆菌rpoB基因531以及526位点的突变,显示当野生反义上游引物的浓度大于10μM时,可完全抑制野生型质粒DNA的PCR扩增;在此条件下,观察到最低检出浓度为1-5×103(IU/ml),其性能完全可以满足临床标本检测的需要。
　　使用本方法对临床182例结核病患者进行检测,并与传统的培养加药敏法,以及PCR直接测序法结果进行比较。结果显示本方法、药敏法以及直接测序法所测得有rpoB基因突变分别为64例,63例,60例。本方法与直接测序法结果经卡方检验,统计学分析,结果显示两种方法检测差异无统计学意义,说明本反义抑制PCR检测方法检测准确可靠。

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前言

材料与方法

1. 试剂材料来源

2. 确认利福平耐药决定区（RRDR）序列

3. rpoB克隆菌株建立

4.引物和荧光探针的设计合成

5.结核杆菌DNA提取

6.结核杆菌DNA rpoB基因突变检测

7. 结核杆菌rpoB基因突变检测特异性和灵敏度研究

8. 结核杆菌临床分离株的培养、RFP药敏表型检测

9. 结核杆菌rpoB基因的核苷酸序列测定

10 临床标本检测

实验结果

1. 结核杆菌 rpoB基因突变检测特异性和灵敏度研究

2. 结核杆菌临床分离株的培养和RFP药敏表型检测

3. 结核杆菌rpoB基因的核苷酸序列测定

4. 临床标本结核杆菌rpoB基因的突变检测

5. 临床样本检测的统计学处理与评价

讨论

全文总结

参考文献

综述

致谢