荧光微球技术在结核杆菌耐利福平菌株rpoB基因突变多重检测中的应用研究

摘要

该研究中，荧光微球技术被引入结核杆菌耐利福平分离株的检测，目的在于建立一种耐利福平rpoB基因突变的多重检测方法，具体的研究工作分为三个方面：1.结核杆菌rpoB基因高频突变区的PCR扩增;2.针对结核杆菌rpoB基因531位和526位两个突变频率较高的位点设计出5条特异性探针，用荧光微球技术对结核杆菌耐利福平菌株rpoB基因的突变进行多重检测;3.荧光微球技术与利福平药敏实验、DNA测序法及PCR-SSCP法的对照分析.

目录

文摘

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英文缩略词表

第一部分综述

1.1前言

1.2耐利福平分子机制的研究现状

1.3分子生物学技术在耐利福平TB检测方面的研究进展

1.3.1 DNA测序法

1.3.2基于聚合酶链反应和电泳分离技术的检测方法

1.3.3基于同源杂交的检测方法

1.4荧光微球技术

1.4.1技术背景

1.4.2荧光微球核酸检测技术的应用现状

1.4.3小结

第二部分实验材料与仪器

2.1所需材料及试剂

2.1.1结核杆菌标准株及结核病患者标本

2.1.2培养基

2.1.3抗结核病药物

2.1.4 PCR引物

2.1.5寡聚核苷酸探针及探针互补序列

2.1.6荧光微球

2.1.7常用生化试剂

2.1.8缓冲液系统

2.2所需仪器

第三部分实验方法

3.1结核杆菌的培养

3.1.1标本预处理

3.1.2结核杆菌的药敏实验

3.2结核杆菌rpoB基因高频突变区的PCR扩增

3.2.1 PCR模板的制备

3.2.2结核杆菌rpoB基因高频突变区的PCR扩增

3.3荧光微球技术对结核杆菌rpoB基因突变的多重检测

3.3.1寡聚核苷酸探针与荧光微球的偶联

3.3.2 rpoB基因高频突变区PCR扩增产物的纯化

3.3.3荧光微球技术对rpoB基因突变位点的多重检测

3.3.4微球表面寡聚核苷酸探针与PCR产物的杂交动力学实验

3.4其他分子生物学方法的对照实验

3.4.1直接测序法分析

3.4.2 PCR-SSCP分析

第四部分实验结果

4.1结核杆菌临床分离株的药敏实验

4.2结核杆菌rpoB基因高频突变区PCR扩增结果

4.3荧光微球技术对结核杆菌rpoB基因突变位点的检测结果

4.3.1荧光微球技术对五种结核杆菌rpoB基因的分型

4.3.2微球表面寡核苷酸探针与PCR产物的杂交动力学实验

4.4其他耐利福平TB分子生物学检测方法的对照结果

4.4.1 DNA测序结果

4.4.1 PCR-SSCP的检测结果

第五部分讨论

小结

参考文献

致谢