小鼠SPK1基因siRNA真核表达载体的构建及转染小鼠Lewis肺癌细胞的研究

摘要

目的:
　　构建靶向小鼠鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase-1,SPK1)基因的RNA干扰(R NA interference,RNAi)载体并转染小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer,LLC)细胞,观察其转染效果,为进一步探索SPK1与非小细胞肺癌之间的关系提供一种技术手段。
　　方法:
　　选取文献已证实有效的、针对小鼠SPK1基因的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列,根据上述序列人工合成模版序列,然后将其和双酶(AgeI和EcoRI)切后的线性质粒载体连接,将连接后的产物转化到感受态细菌中,对在含抗生素的培养皿中长出的菌落进行PCR扩增,然后对其进行电泳及测序分析。通过转基因技术利用脂质体将其导入小鼠Lewis肺癌细胞中,荧光显微镜下观察绿色荧光、流式细胞仪检测其转染效率,免疫印迹检测SPK1蛋白的表达。
　　结果:
　　经酶切、测序验证,小鼠SPK1基因的siRNA真核表达载体构建成功;荧光显微镜下观察见转染后的小鼠LLC细胞中有较多带绿色荧光的细胞出现;流式细胞仪检测该载体转染小鼠LLC细胞的效率为79.5％;免疫印迹检测证实SPK1蛋白在转染后的小鼠Lewis肺癌细胞中表达下降。
　　结论:
　　成功构建以小鼠SPK1基因为靶标的siRNA表达载体,且有效下调小鼠Lewis肺癌细胞中SPK1蛋白的表达,为进一步研究SPK1与非小细胞肺癌之间的关系,奠定了实验基础。

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英文缩略词表（Abbreviations）

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1、材料

2、方法

结果

1、载体酶切线性化

2、克隆PCR后电泳鉴定

3、测序

4、转染后荧光显微镜下观察及流式细胞仪检测转染效率

5、免疫印迹法（Western blotting）检测转染后小鼠Lewis肺癌细胞SPK1蛋白的表达变化

附图

结论

讨论

参考文献

综述

参考文献

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