比较移植及体外培养对小鼠卵巢卵泡早期发育的影响

摘要

小鼠模型被广泛应用于卵巢始基卵泡激活(初始募集)基本规律及各种生长分化因子调控作用的研究中。离开体内的自然环境,卵巢必须适应环境的改变,比如二氧化碳浓度、营养供给、温度及酸碱度。更重要的是,离开体内调节系统卵泡的生长会发生改变。近几年,卵巢的孵育方法主要包括体外培养和肾被膜下移植。但没有文献报道不同孵育体系对卵巢发育的影响,及孵育卵巢和在体卵巢间卵泡发育的区别。在本研究中,我们比较了体外培养卵巢、移植卵巢及体内生长卵巢中各级卵泡的数量。用免疫组化技术和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测三个重要基因的表达及蛋白定位,包括透明体蛋白3(ZP3)、生长分化因子9(GDF-9)和抗苗勒氏管激素(AMH)。结果显示,体外培养加速卵泡激活、延缓发育卵泡的生长,影响ZP3、GDF-9和AMH蛋白的表达模式。尽管移植造成少量始基卵泡的丢失,但移植卵巢的特征与体内生长卵巢非常相似,这一结果提示移植可以提供最佳的卵泡孵育环境。在体外培养体系中,alpha-Modifie Eagle Medium(α-MEM)是较好的基础培养基。本实验系统研究了孵育卵巢与体内生长卵巢间的相同及不同,证明了移植可以最好的模拟体内卵巢生长环境。
　　【目的】探讨microRNA-145(miR-145)对小鼠颗粒细胞增殖、分化和甾体激素合成的调节作用及机制。
　　【方法】选择3周龄未性成熟小鼠卵巢,用原位杂交技术检测miR-145的表达。应用机械法获取3周龄小鼠卵巢窦状卵泡中的颗粒细胞进行体外培养。用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测颗粒细胞中miR-145、分化相关基因及激素合成酶mRNA的表达。胸腺嘧啶核苷类似物(EdU)方法检测颗粒细胞增殖。用免疫组织化学法检测颗粒细胞分化关键基因蛋白的表达。
　　【结果】miR-145在小鼠卵巢窦状卵泡的颗粒细胞中高表达,始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡及卵巢间质中未见明显表达。在体外培养颗粒细胞中,miR-145的表达受卵泡刺激素(FSH)的调节。下调miR-145可显著抑制颗粒细胞的增殖、分化,并且通过降低孕激素合成相关酶表达而抑制孕激素的合成分泌,而对雌激素合成没有影响。
　　【结论】miR-145参与调节颗粒细胞增殖、分化及甾体激素合成,但其具体机制仍有待进一步研究。

目录

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声明

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第一部分比较移植及体外培养对小鼠卵巢卵泡早期发育的影响

中文摘要

英文摘要

INTRODUCTION

MATERIALS AND M ETHODS

Animals

Ethics Statement

Reagents

In vitro ovarian culture

Transplantation

Morphological Analysis and Follicle Counting

Immunohistochemistry

RNA isolation and real-time polymerase chain reaction \(PCR\)

Statistical analysis

RESULTS

DISCUSSION

参考文献

Table 1

第二部分Mir-145对小鼠颗粒细胞增殖分化和甾体激素合成的调节作用及机制探讨

前言

材料与方法

1.1实验动物

1.2 颗粒细胞的获取

1.3 miR-145 antagomir 转染

1.4 EdU检测细胞增殖

1.5 原位杂交

1.6 RNA的提取、逆转录及RT-PCR

1.7 免疫组化及HE染色

1.8统计学处理

实验结果

2.1 miR-145在小鼠卵巢窦状卵泡颗粒细胞中高表达

2.2 FSH可增加颗粒细胞中miR-145的表达

2.3 下调miR-145表达抑制颗粒细胞增殖

2.4下调miR-145表达抑制颗粒细胞分化

2.5 下调miR-145表达抑制颗粒细胞孕激素合成

讨论

参考文献

第三部分 综述

参考文献

致谢