ABCB6突变导致遗传性泛发型色素异常

摘要

遗传性泛发型色素异常症(DUH)是一种遗传性皮肤色素异常,以全身泛发性色素沉着斑和色素减退斑相互夹杂存在为典型特征。该病与1933年被报道,但发病的病理机制尚不清楚。遗传学上已发现两个DUH致病位点,分别定位于6q24.2-q25.2和12q21-q23,但迄今为止其致病基因尚未被克隆。
　　本论文中,我们研究了一个湖北枣阳五代汉族DUH家系,首先通过微卫星连锁分析将致病基因定位于2q33.3-2q36.1,其中微卫星标记D2S2382的LOD值为3.49。将家系中一个正常和两个病人的DNA样本进行外显子测序,结果发现了29个变异。这29个变异中位于2q33.3-2q36.1的仅有位于ABCB6基因内的c.1067T>C(p.Leu356Pro),家系中的其他成员的DNA测序,发现家系中所有的病人都含有这个突变,而所有的正常人都不携带此突变。对500个湖北正常人进行ABCB6的c.1067T>C突变验证,在所有正常人对照中均未检测到此突变。在6个散发的DUH病人中,进行ABCB6基因突变分析,发现其中的两个病人分别具有两个不同的ABCB6错义突变,分别为c.508A>G(p.Ser170Gly)和c.1736G>A(p.Gly579Glu),而对400个正常人进行DNA测序验证,均未发现这两个突变。
　　ABCB6是ABC转运蛋白(ATP-bindingcassettetransporter)家族成员。为从功能上了解释ABCB6与DUH发病之间的关系,我们首先检测了ABCB6在皮肤组织和细胞中的表达。取正常人表皮进行免疫组化检查,发现ABCB6在表皮基底层中高表达,并在黑素细胞和角质化细胞中都呈现胞质定位。人黑素瘤细胞A375和人角质化细胞系HaCaT中的Western蛋白印迹实验,证实了ABCB6在这两种表皮细胞中均有表达。进一步构建ABCB6野生型及三个突变型的EGFP融合蛋白,在鼠黑素瘤细胞B16-F1中观察ABCB6蛋白的亚细胞定位,发现ABCB6在细胞质中呈现类似黑素小体的分布,并且可在突触中聚集,而导致DUH的突变则破坏了ABCB6蛋白的正常定位,突变型ABCB6蛋白不能呈现在细胞质中的正常分布,主要滞留在细胞核周围的高尔基体中。
　　本论文鉴定了第一个遗传性泛发型色素异常的致病基因,并对ABCB6突变引起DUH的病理机制进行初步研究。我们的发现为进一步研究ABCB6功能,揭示DUH这一疾病的分子病理机制打下了良好的基础。人类皮肤色素形成是一个复杂而有趣的生理过程,受到内外环境因子的精确调控,发现ABCB6作为一个新的色素调控因子,也为色素代谢的研究开拓了一个新的方向。

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1 前言

1.1 DUH研究综述

1.2 皮肤的结构、发生与功能

1.3 黑色素的生成与调节简介

1.4 ABC转运蛋白综述

1.5 ABCB6研究简介

1.6 相关实验技术原理

1.7 研究目的及意义

2 患者、材料和方法

2.1 患者

2.2 提取家系成员基因组DNA

2.3 连锁分析和基因分型

2.4 外显子捕获和测序

2.5 变异鉴定及突变筛查

2.6 免疫组化

2.7 Western 蛋白印迹

2.8 载体构建

2.9 细胞培养

2.10 质粒转染和荧光观察

3 实验结果

3.1 家系调查和临床特征

3.2 连锁分析

3.3 外显子测序鉴定候选基因

3.4 ABCB6基因突变筛查及保守性分析

3.5 ABCB6在人表皮细胞中的表达

3.6 突变影响了ABCB6正常定位

3.7 ABCB6突变型在高尔基体中滞留

4 讨论

5 全文总结与展望

5.1 本论文的主要研究成果

5.2 主要创新点

5.3 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间发表的论文

附录2 主要符号及缩略词表