E抗原阳性慢性乙型肝炎经治患者干扰素的应答及其信号通路研究

摘要

目的：
　　我国是乙肝大国，慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）患者人数众多，由其导致的终末期肝病严重威胁人们健康。有效的抗病毒治疗可以减少肝纤维化、肝硬化、肝癌等并发症的发生，显著改善预后。目前乙肝抗病毒治疗的药物主要分为两大类，一类为核苷类似物（Nucleotide Analogues,NAs），在我国使用的NAs主要有4种：拉米夫定（LAM），阿德福韦酯（ADV），替比夫定(LDT)，恩替卡韦（ETV）。另一类药物为干扰素(IFN),包括普通IFN和长效IFN（Peg-IFN）。NAs和IFN作用特点各有不同：NAs抑制病毒复制的作用很强，同时口服给药，携带使用方便，副作用较小。缺点是较难获得理想的治疗终点，即HBeAg/HBsAg血清学转换或者HBsAg的清除，同时停药后容易复发。另外NAs需要长时间服药，易导致耐药的风险。IFN的治疗优势是有限疗程（一般12个月，有的可以延长到18个月），以及高的HBeAg/HBsAg血清学转换率和清除率，获得持久的免疫学控制，停药后复发率低。缺点是使用较为复杂，副作用较多，同时病毒自身可进化并开发出各种策略抑制IFN相关信号通路的活化，导致IFN使用效率降低。CHB患者的优化/个体化治疗已成为国内外研究的热点，已经有很多学者尝试利用IFN和NAs这两类药物各自的优势，采用更好的治疗方案，例如联合，序贯治疗，以获得更好的临床治疗效果。
　　从IFN的分子机制来说，在乙肝抗病毒治疗中它是唯一同时具有抗病毒和直接免疫调节作用的药物。体外研究表明：IFN抗病毒效应是通过如下机制实现的，IFN进入体内后首先与细胞表面IFN受体结合，活化多种信号分子，例如STAT1（信号转导和转录激活分子1）,进而激活经典的JAK/STAT信号通路，诱导下游抗病毒效应基因的产生而发挥抗病毒作用。在这些效应基因中，以抗粘液病毒蛋白（MxA），2‘,5‘-寡腺苷酸合成酶（2‘,5‘-OAS）,蛋白激酶R（PKR）等最为重要。MxA是IFN诱导产生的分布于细胞质中的蛋白质，具有广谱的抗病毒活性，对正黏病毒、棒状病毒、小RNA病毒及乙肝病毒均有强大的抑制作用。而2‘,5‘-OAS可以启动核酸水解酶，通过选择性地降解病毒RNA来发挥抑制病毒的作用。JAK/STAT通路存在一些负性调控基因来抑制其活化，在IFN激活JAK/STAT通路的同时，这些负性调控基因也会通过负反馈被激活，来避免信号通路的过度活化。在这些负性调控因子中，以SOCS3(细胞因子信号通路抑制分子3)、PIAS（STAT1激活抑制蛋白）等最为重要。SOCS3能通过结合磷酸化的细胞因子受体,使JAKs失活,抑制信号转导。相比较而言,PIAS更像缓冲剂,通过控制活化STAT的数量来调节靶基因的转录。
　　在慢性乙型肝炎治疗中，IFN应答率并不高，说明IFN抵抗的情况可能出现在慢性乙肝患者治疗中。同时IFN在治疗慢性乙型肝炎过程中发挥抗病毒，免疫调节作用以及病毒抵抗IFN的分子机制尚未完全阐明。OSST临床研究是一项在HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者中使用Peg-IFN-α和ETV联合或序贯治疗以优化血清学转换的研究，本文的研究对象为一部分来自OSST临床试验的患者。我们将患者临床应答情况与IFN的信号通路研究相结合，观察不同临床结局患者外周血和肝组织中相关信号分子的表达情况，并进一步比较其差异。研究结果为使用NAs治疗的CHB患者优化治疗策略提供了新的理论依据。同时深化了对IFN治疗CHB患者相关分子机制以及病毒抵抗机制的理解，为进一步寻找IFN治疗相关预测指标以及靶点提供了新的研究思路。
　　本研究内容如下：
　　1.将E抗原阳性慢性乙型肝炎经治患者（使用ETV治疗，并获得持续病毒学控制的患者）随机分为两组，A组序贯使用IFN治疗，B组继续使用ETV治疗。同时在治疗过程中观察相关临床指标HBV DNA、HBeAg、HBsAg、ALT的动态变化，并比较48周，96周时两组间总应答率(HBeAg/HBsAg血清学转换，HBsAg清除)的差异，以期望能发挥两种药物各自的优势，使患者获得更加理想的治疗终点。
　　2.观察患者PBMC和肝组织中IFN相关信号通路分子治疗过程中的动态变化并比较组间（有应答和无应答组）差异，同时结合临床应答，尝试建立两者间的联系。
　　方法：
　　1.基于上述研究背景，选取同济医院单中心的E抗原阳性慢性乙型肝炎经治患者（这些患者属于OSST临床研究中的一部分）。入组标准为已使用ETV治疗9-36月，HBV DNA阴性但未发生HBeAg血清学转换。按照随机分组的原则将患者分到A组和B组，每组各27名患者。A组使用Peg-IFN规范治疗一年(初始8周使用ETV+IFN联合治疗)，治疗结束后继续随访一年，B组继续使用ETV治疗。治疗过程中动态观察临床相关指标的变化，并在48周，96周时比较两组间总应答率的差异。
　　2.为了深入研究IFN信号通路以及其下游的抗病毒效应分子和治疗应答的关系，收集了本中心A，B两组各27名慢性乙型肝炎患者不同时间点（0、4、12、24、36、48、72、96周）的外周血标本并分离PBMC，将PBMC分别提取RNA和蛋白。使用Real Time PCR检测PBMC中STAT1，MxA，2‘,5‘-OAS和SOCS3在治疗过程中的动态变化情况，同时使用Western-Blot方法检测了IFN信号通路关键分子磷酸化STAT1的表达。
　　3.收集了部分A组患者治疗前后（0，48周）肝组织标本，采用Real Time PCR方法检测了治疗前后STAT1，MxA，2‘,5‘-OAS以及SOCS3的表达，同时用免疫组织化学（IHC）的方法检测了肝组织中磷酸化的STAT1以及SOCS3在治疗前后的表达情况，以进一步明确IFN治疗前后信号通路关键分子，负性调控基因与治疗结局之间的联系。
　　结果:
　　1.A，B两组患者基线特征无差异。A组内有应答患者和无应答患者基线HBsAg有显著差异，治疗过程中A组患者HBsAg的下降幅度显著高于B组，A组内有应答患者HBsAg治疗过程中下降幅度显著高于无应答患者。在48周，96周时，A组的总应答率(HBeAg/HBsAg血清学转换，HBsAg清除)高于B组（22.2％vs3％，37％vs3％）。
　　2.A组患者在使用IFN治疗后，PBMC中STAT1，MxA，2‘,5‘-OAS，SOCS3的mRNA水平均有增高，而使用NAs治疗的B组患者PBMC中这些分子的表达没有明显变化。进一步在A组内比较发现，A组内应答和未获得应答患者PBMC中基线SOCS3的mRNA水平有显著差异。与基线相比较，A组有应答患者PBMC中4周时STAT1和4周，12周时MxA的mRNA增长幅度显著高于未获得应答的患者。和基线相比较，4周时磷酸化STAT1蛋白水平的增长幅度在A组有应答和无应答患者间有显著差异。HBsAg的下降幅度（0周-48周）分别和STAT1，MxA的mRNA增长幅度（STAT14周/0周，MxA12周/0周）正相关。
　　3.A组患者肝组织磷酸化STAT1免疫组化染色结果显示：未获得应答者基线磷酸化STAT1的表达显著高于有应答患者，有应答患者48周时磷酸化的STAT1表达较基线相比明显上调，无应答患者48周时磷酸化STAT1的表达水平未见明显变化。和基线相比，有应答患者48周STAT1，MxA的mRNA水平增长幅度显著高于无应答患者。有应答患者48周时SOCS3的mRNA水平的上调幅度显著低于无应答患者，SOCS3免疫组化染色结果也进一步证实了这一结果。
　　结论:
　　1.在NAs治疗取得了持续病毒学应答，但未出现血清学转换的慢性乙肝患者，转换为序贯使用IFN治疗可以有效提高此类患者的血清学转换率，获得理想的治疗终点。从研究结果来看，这种序贯治疗方案治疗效果优于继续单用NAs治疗。
　　2.在PBMC中的研究表明：IFN信号通路中的STAT1分子，下游抗病毒蛋白MxA mRNA水平早期的增长幅度以及SOCS3的基线水平和患者的治疗结局有关，STAT1和MxA的增长幅度和治疗过程中HBsAg的下降程度正相关，提示这些基因一定程度上可以预测IFN的疗效。
　　3.肝组织中研究表明：基线磷酸化STAT1水平较高的患者对IFN治疗的应答较差，48周时磷酸化STAT1表达水平显著上调的患者应答较好。治疗前后（48周/0周）肝脏中STAT1，MxA，SOCS3的增长幅度和治疗结局相关。

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英文缩略语对照表

中文摘要

英文摘要

第一部分 E抗原阳性慢性乙型肝炎经治患者的干扰素临床应答

前言

1材料与方法

2 结果

讨论

参考文献

第二部分 E 抗原阳性慢性乙型肝炎经治患者外周血干扰素的信号通路研究

前言

结果

讨论

参考文献

第三部分 E 抗原阳性慢性乙型肝炎经治患者肝组织中干扰素的信号通路研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

英文缩略语对照表（综述部分）

综述

参考文献

附录

致谢