pcDNA3.1（-）-hACE2真核表达载体在胰岛内皮细胞的表达及对细胞功能的影响研究

摘要

本文从以下几个方面进行论述：
　　第一部分
　　目的：本研究运用真核表达载体pcDNA3.1(-)将目的基因hACE2通过Lipofectamine转染到胰岛内皮细胞MS-1中，提高细胞内ACE2基因的表达，并探索最佳的转染条件。
　　方法：将构建好的携带目的基因的重组质粒从大肠杆菌中成功提取，通过MTT法测定MS-1细胞的生长曲线，以确定细胞的对数生长周期，将重组质粒转入到内皮细胞MS-1中，通过Western blotting检测转染是否成功并且测定不同的接种浓度和不同的质粒与脂质体混合比例下的转染效率。
　　结果：与对照组相比，hACE2转染MS-1细胞后，细胞中ACE2的表达量上升了79％，差异有统计学意义（P﹤0.05）。在以质粒 DNA与脂质体的混合比例为4μg:10μL的转染条件下，6孔培养板上MS-1细胞接种密度为5×104/cm2时ACE2蛋白表达量较高（P﹤0.05）；在接种密度为5×104/cm2条件下，3μg:9μl的混合比例转染后的ACE2表达量高于其它混合比例（P﹤0.05）。
　　结论：成功运用阳离子脂质体细胞转染技术将携带hACE2的真核表达载体转染到MS-1细胞。
　　第二部分
　　目的：胰岛内皮细胞对β细胞功能起着重要的作用，胰岛内皮细胞功能障碍和微循环完整性的丧失可能参与了糖尿病发病中胰岛β细胞功能障碍的发生过程。在胰腺的胰岛和内皮细胞等发现了完整的RAS系统，除了经典的ACE/ngII/AT1通路外，新近发现的ACE2一方面降低AngII的含量，另一方面其催化产物Ang（1-7）又发挥拮抗AngII的效应，以ACE2为干预靶点调控胰岛内皮细胞功能，可能是逆转β细胞损害的一个新途径。为了进一步研究胰岛内ACE2-Ang1-7-Mas通路的功能及其对内皮细胞功能的调控机制，本研究将ACE2转染成功的胰岛内皮细胞MS-1通过高脂或者高糖干预诱导内皮细胞损伤，探讨ACE2-Ang（1-7）-Mas通路对胰岛微循环内皮细胞的保护作用。
　　方法：将成功转染ACE2的MS-1细胞和未转染的正常MS-1细胞用高糖(25mM)或者棕榈酸(0.125mM)干预48h，并用Mas受体阻断剂A779、PI3K阻断剂wortmannin、eNOS阻断剂L-NAME以及JNK阻断剂SP600125分别进行干预，Western blotting检测MS-1细胞AKT-eNOS-NO信号通路的改变以及JNK磷酸化的表达变化，RT-PCR检测ICAM-1mRNA和VCAM-1mRNA的含量，一氧化氮检测法检测上清中NO的含量。
　　结果：在正常生理条件下，与对照组相比，ACE2过表达可以显著提高MS-1细胞的AKT(ser473)磷酸化水平（P﹤0.05），eNOS(ser1177)的磷酸化水平和NO含量有上升趋势（P﹥0.05）；在25mM高糖培养48h条件下，与未转染 ACE2的MS-1细胞相比，ACE2过表达提高了高糖环境中AKT(ser473)，eNOS(ser1177)磷酸化水平（P﹤0.05），显著增加了MS-1细胞的NO释放量（P﹤0.05），并且逆转了MAPK通路中 JNK（Thr183/Tyr185）磷酸化的激活（P﹤0.05），ACE2过表达也可以降低高糖中MS-1细胞的ICAM-1和 VCAM-1mRNA的含量。用10-6mMAng(1-7)干预也表现出相同的结果；同时在0.125mM棕榈酸培养48h后，与未转染ACE2的MS-1细相比，ACE2过表达同样提高了下的AKT(ser473)， eNOS(ser1177)磷酸化水平（P﹤0.05），显著增加了NO释放量（P﹤0.05），并且降低了JNK（Thr183/Tyr185）的磷酸化（P﹤0.05），ACE2过表达也降低高脂中MS-1细胞的ICAM-1和VCAM-1mRNA的含量。
　　结论：高糖或者高脂会导致胰岛内皮细胞胰岛信号通路中AKT，p-eNOS磷酸化表达的下降，进而内皮细胞NO释放量下降，并引起炎症反应通路JNK表达的增强，以及ICAM-1和VCAM-1mRNA含量的上升。ACE2可上调MS-1细胞内Akt-eNOS-NO信号通路活性，改善MS-1细胞功能，并且通过加强Akt-eNOS-NO信号通路、抑制JNK磷酸化及ICAM-1和VCAM-1在内皮细胞上的表达而逆转高糖或者高脂对胰岛内皮细胞功能的损害。

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英文缩略词表

前言

第一部分：pcDNA3.1(-)-hACE2在胰岛内皮细胞MS-1的表达

中文摘要

英文摘要

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

第二部分：ACE2过表达对生理、高脂或者高糖培养条件下胰岛内皮细胞MS-1功能的影响

中文摘要

英文摘要

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

附录：攻读硕士学位期间发表的文章

致谢