“鸡尾酒”重组卡介苗的免疫原性和抗结核分枝杆菌感染的保护性

摘要

背景与目的:预防结核病的卡介苗（BCG）自发明以来在全球广泛接种，能有效预防儿童重症结核，但对成人肺结核保护性较差。BCG主要诱导产生CD4+Th1免疫应答、且该应答随时间延长减弱，保护期仅10~15年；诱导CD8+T细胞应答较弱，不能阻止体内潜伏感染细菌的再次激活。因此，在卡介苗已有的保护性和安全性优势的基础上，拟针对卡介苗的不足改造卡介苗，用于结核病的预防，具有重要意义和实践价值。结合结核分枝杆菌在感染机体后存在的不同状态且表达不同的抗原谱和机体抗感染的免疫保护机制，本研究拟将前期构建的、分别过表达结核分枝杆菌免疫优势抗原Ag85A、Ag85B和HspX的三株增强型重组卡介苗，即rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X，按等比例混合，综合利用其各自优势，制成“鸡尾酒”重组卡介苗ABX。与亲代卡介苗分别免疫小鼠，评价其抗结核分枝杆菌的短期保护效应以及比较分析疫苗的免疫原性，为完成重组卡介苗 ABX菌株的临床前研究奠定基础。
　　方法:1.评价重组卡介苗ABX抗M.tb急性感染保护性：将rBCG::85A、rBCG::85B和rBCG::X等比例配伍，制成重组卡介苗，命名为 ABX，作为实验组（1.02×106CFU/100μl/只）；亲代BCG作为阳性对照组（1.5×106CFU/100μl/只），PBS免疫作为阴性对照组（100μl/只）。免疫C57BL/6小鼠8周后，尾静脉注射M.tb H37Rv毒株(1.2×106CFU/只)攻击感染。感染4周后，分别检测小鼠肺脏和脾脏的细菌载量以及病理改变，观察存活率。
　　2.评价重组卡介苗ABX的细胞免疫应答：同上免疫C57BL/6小鼠，免疫后12周和32周后，收集脾细胞。
　　（1）ELISA检测抗原Ag85A、Ag85B和HspX特异性的TNF-α、IFN-γ、IL-2及IL-4水平，以PPD刺激为阳性对照，RPMI1640为阴性对照。
　　（2）流式细胞仪(FCM)结合胞内因子染色法(ICS)分析抗原特异性的CD4+T细胞中分泌TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+细胞总数，进一步分析单阳、双阳和三阳性多功能CD4+T细胞。以PPD刺激为阳性对照，RPMI1640为阴性对照。
　　（3）CFSE标记法检测体内Ag85B特异的CD8+T细胞的CTL杀伤活性。
　　3.评价重组卡介苗ABX的免疫记忆水平：利用流式细胞术，以CD62L、CD44表达作为分选标志，分别检测Ag85A、Ag85B和HspX抗原的CD4表位肽，Ag85B抗原CD8表位肽特异性的TCM（CD62Lhi CD44hi）、TEM（CD62Llo CD44hi）水平；同时结合胞内细胞因子染色，进一步分析 TEM细胞群中分泌IFN-γ和TCM细胞群中分泌IL-2的细胞数。
　　4.评价重组卡介苗ABX的体液免疫应答：ELISA检测小鼠血清中Ag85A、Ag85B和HspX特异性的抗体总IgG及亚类IgG1、IgG2a的水平。
　　结果:1.重组卡介苗ABX增强抗M.tb急性感染的保护性：与亲代BCG免疫小鼠相比，ABX组小鼠的肺脏荷菌量显著降低（p=0.001），比BCG组减少0.585log；病理变化更轻微；肺脏切片偶见少量抗酸杆菌；短期存活率达100％。
　　2.重组卡介苗ABX诱导产生抗原特异性的细胞免疫应答：
　　（1）免疫后12周和32周，与BCG组比较，ABX组产生较高水平的Ag85A、Ag85B和HspX特异性TNF-α、IFN-γ。在免疫后12周，ABX组产生Ag85B、HspX和PPD特异性IL-2水平高于BCG组（p<0.05）。随时间延长三种细胞因子分泌量增加。抗原特异性的IL-4的浓度在各组间均低于30pg/mL，且无统计学差异。
　　（2）免疫后12周和32周，ABX疫苗组抗原特异性CD4+T细胞中分泌IFN-γ和TNF-α的细胞总数比BCG组显著增加，IL-2细胞总数随免疫时间延长，显著升高。进一步分析多功能CD4+T细胞数量，ABX疫苗组诱导产生抗原特异性的TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+单阳细胞及TNF-α+-IFN-γ+双阳细胞最为显著，均不同程度高于BCG组（p<0.05）。同时，Ag85A特异性的三阳，Ag85B特异性的IFN-γ+-IL-2+双阳细胞也均显著高于BCG组（p<0.05）。
　　（3）免疫后12周和32周，ABX组靶向Ag85B的特异性杀伤率分别为28.8％和30.7％，分别显著高于BCG组的9.64％和8.47％（p<0.05）。
　　3.重组卡介苗ABX维持较高免疫记忆水平：Ag85A、Ag85B、HspX的CD4抗原肽刺激，ABX组在免疫后12周和32周特异性TCM、TEM细胞数均高于BCG组，并且以TEM细胞为主（p<0.05）。Ag85B的CD8抗原肽刺激，ABX疫苗组以TCM细胞较多。分泌IL-2、IFN-γ的记忆细胞随时间延长，细胞数增加。
　　4.重组卡介苗ABX诱导产生高水平的特异性抗体：与BCG免疫小鼠比较，ABX免疫小鼠32周产生较高水平Ag85A、Ag85B和HspX特异性抗体，尤其以IgG2a最显著（p<0.05），且明显高于免疫后12周水平（p<0.05）。ABX疫苗组IgG2a:IgG1比值大于1，随时间延长，更趋向于Th1型免疫应答。
　　结论:“鸡尾酒”重组卡介苗ABX免疫对急性攻毒感染小鼠具有很强的免疫保护性，其保护性有赖于能诱导稳定、持久的与过表达抗原相关的特异性CD4+Th1型细胞免疫应答，主要产生以TNF-α+、IFN-γ+、IL-2+单阳细胞及TNF-α+-IFN-γ+双阳为特征的CD4+多功能T细胞，并增强了CD8+T细胞的特异性杀伤活性，同时维持较高水平的免疫记忆细胞及特异性抗体水平。这些结果揭示，“鸡尾酒”重组卡介苗ABX既继承亲代BCG对预防原发感染的优势，也显著增强亲代BCG的免疫原性、免疫记忆和免疫保护性，是具有良好应用前景的候选疫苗。

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前言

材料和方法

结果

一、“鸡尾酒”重组卡介苗（ABX）抗M.tb急性感染的保护性

（一）ABX疫苗免疫显著降低M. tb急性感染小鼠肺脏的荷菌量

（二）ABX疫苗免疫显著减轻了M.tb急性感染小鼠肺脏的组织病理学改变

（三）ABX疫苗免疫显著提高了M.tb感染小鼠的短期幸存率

二、“鸡尾酒”重组卡介苗（ABX）的免疫原性

（一）ABX疫苗诱导免疫小鼠产生高水平的抗原特异性Th1型细胞因子

（二）ABX疫苗诱导免疫小鼠产生抗原特异性多功能CD4+T细胞

（三）ABX疫苗提高免疫小鼠体内CTL特异性杀伤活性

（四）ABX疫苗诱导免疫记忆细胞及效应因子的产生

（五）ABX疫苗免疫小鼠诱导产生持久的抗原特异性的Th1型抗体应答

讨论

参考文献

综述

参考文献

附录

致谢