14-3-3蛋白在阿尔茨海默病SET核运输中的作用及其分子机制研究

摘要

本文主要从以下几个方面展开论述：
　　第一部分 探讨过表达14-3-3β/δ对SET核运输障碍的影响及其潜在的分子机制，为AD药物开发提供有效的分子靶点。
　　背景：PP2A活性下降导致 tau过度磷酸化，进而促进神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)形成，是阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)发病的关键环节。核蛋白SET是体内PP2A特异、高效的抑制剂，主要分布在嗅球、海马、大脑皮质、尾壳核、丘脑等脑区。AD患者经免疫化学检测发现脑内SET表达水平明显增高，而且细胞定位也从细胞核转至细胞浆，并且发现SET共定位于神经元胞浆内PP2A及过度磷酸化的tau蛋白。前期研究发现：过表达SET导致大鼠PP2A活性显著降低，tau异常过度磷酸化，神经元退变，甚至出现AD患者样运动功能障碍的表现。上述研究结果说明：作为PP2A上游调节因子，SET在AD脑内自核转运并滞留于胞浆聚集是引起AD发病的一个非常关键的因素。因此，明确AD脑内SET核运输的具体机理将有助于诠释AD的发病机制。然而SET如何转运并聚积于胞浆内，以及PP2A活性被SET所抑制的具体分子机制尚不清楚。前期针对SET核运输相关的核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)序列展开了相应研究，结果发现：Ser-9位点磷酸化失活SET核定位信号，造成核输入蛋白不能正常结合SET，导致SET滞留胞浆。然而，AD患者脑内SET Ser-9磷酸化的分子机制及其它可能致SET滞留胞浆聚集的机制有待进一步明确。14-3-3蛋白作为接头/支架蛋白与其他蛋白质结合，广泛参与了细胞凋亡、细胞分裂、信号转导、蛋白跨膜转运等重要生命活动的调节进程。近来更多的研究揭示了14-3-3蛋白在核运输中的调控作用。比如Cdc25蛋白的Ser-216被磷酸化后可以与14-3-3ε结合形成Cdc25/14-3-3ε复合物，并导致Cdc25不能结合importinα正常进入到细胞核中，类似的还有RSG，HDAC4蛋白等。这些研究均提示：14-3-3蛋白对于核-浆穿梭蛋白的核输入具有负调作用。同时，14-3-3β/δ在AD患者脑内过表达，存在于NTFs中，与AD患病进程正相关。这些研究提示：14-3-3β/δ蛋白参与了AD的病理过程，但具体机制不明。具有核输入负调作用的14-3-3蛋白与其靶蛋白结合存在识别序列 RX1-2SX2-3S(X代表基本氨基酸)，通过筛选SET的全长，发现其146 NESGDPSSKST156序列，符合14-3-3蛋白识别序列RX1-2SX2-3S，提示：14-3-3蛋白可能通过结合SET导致其滞留胞浆，抑制PP2A活性，参与AD发病。本研究证实：14-3-3通过与核输入蛋白 importinα竞争性结合 SET，导致核输入复合物形成障碍，SET入核困难而滞留胞浆，进而引起AD下游病理事件。
　　目的：探讨过表达14-3-3β/δ对SET核运输障碍的影响及其潜在的分子机制，为AD药物开发提供有效的分子靶点。
　　方法：培养HEK293/tau细胞，转染表达14-3-3β/δ48 h后通过共聚焦/双光子显微镜和WB检测SET的亚细胞分布。通过Co-IP方法检测过表达14-3-3β/δ组SET与14-3-3β/δ及核输入蛋白Importinα的结合程度。通过筛选SET全长，发现其146 NESGDPSSKST156序列，符合14-3-3蛋白识别序列RX1-2SX2-3S，为此，合成具有穿膜和透血脑屏障功能的纯化Tat肽段Tat-NESGDPSSKST(Peptide1)，和乱序序列作为对照的Tat肽段Tat-NSSTEDGPKSS(Peptide2)。在HEK293/tau细胞转染表达14-3-3δ的同时加入人工合成并纯化Tat肽段，48h后通过共聚焦/双光子显微镜和WB检测SET的亚细胞分布。通过Co-IP方法检测加入Peptide1/2组是否影响SET与14-3-3β/δ及核输入蛋白Importinα的结合。通过PP2A活性检测试剂盒(Promega, Cat.＃ V2460)测定过表达14-3-3β/δ及Peptide1/2干预后对PP2A活性的影响。利用免疫印迹方法检测过表达14-3-3β/δ，SET，14-3-3β/δ+SET后对tau蛋白Ser199，Ser202，Thr205，Thr231, Ser262，Ser396和 Ser404位点磷酸化程度的影响；人工包装过表达14-3-3δ的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)，通过腺相关投递系统感染C57小鼠，分别用Peptide1/2干预，进一步明确SET与14-3-3蛋白的结合序列NESGDPSSKST，确定其可能成为促进SET入核的小分子肽，为AD有些药物开发提供候选分子靶点。通过条件恐惧实验，水迷宫实验来检测行为学的变化，激光共聚集荧光显微镜下观察脑片上SET蛋白的亚细胞定位。64位阵列系统检测活体脑片海马DG区到CA1区LTP变化，体外原代培养大鼠胚胎海马神经元检测神经元树突，树突棘等的变化，免疫印迹实验检测小鼠海马synaptotagmin， synaptophysin， synapsin1，phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)，NR1，NR2A和NR2B等突触蛋白及SET Ser-9磷酸化的变化。
　　结果：在HEK293/tau细胞株中，分别过表达14-3-3β/δ导致大部分SET自核转运并滞留于胞浆。分别分离提取胞浆及胞核蛋白后，发现过表达14-3-3β/δ组细胞核内的SET蛋白量明显减少，而在胞浆中明显增加；通过免疫共沉淀方法检测到过表达14-3-3β/δ后SET与importinα结合减少导致SET核输入障碍。还观察到在转染了14-3-3δ的HEK293/tau细胞株中，用Peptide1处理导致SET正常转运到细胞核中。利用核蛋白提取试剂盒分离提取胞浆与胞核蛋白，发现核蛋白中Peptide1处理组的SET量明显增高，而在胞浆蛋白中明显减少；通过免疫共沉淀方法检测到Peptide1处理组SET与importinα结合随剂量逐渐增加。还观察到过表达14-3-3β/δ后显著抑制PP2A活性，并导致tau蛋白在Ser199，Ser202，Thr205，Thr231，Ser262，Ser396和 Ser404位点发生过度磷酸化，Peptide1处理可恢复PP2A活性。进一步在小鼠海马齿状回(Dentategyrus，DG)定位注射AAV8-14-3-3δ病毒感染动物，并用Peptide1/2干预，发现过表达14-3-3δ后，小鼠情景恐惧实验和水迷宫实验均表现学习和记忆的障碍，而Peptide1处理可以有效恢复。激光共聚集荧光显微镜下观察到脑片中不同区域Peptide1可以恢复过表达14-3-3δ引起的SET胞浆滞留现象。64位阵列系统检测活体脑片海马DG区到CA1区LTP变化，发现过表达14-3-3δ可以显著抑制LTP，而Peptide1处理可以有效恢复，体外原代培养大鼠胚胎海马神经元发现过表达14-3-3δ可导致神经元树突长度缩短，分支减少，树突棘密度减少等变化，而Peptide1处理可以有效恢复，免疫印迹实验检测发现在小鼠海马蛋白中，过表达14-3-3δ可导致synaptotagmin，synaptophysin， synapsin1，phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突触前蛋白减少，NR2A：NR2B比值变大，SET Ser-9显著磷酸化，Peptide1处理可以有效恢复上述变化。
　　结论：14-3-3β/δ可以通过与SET蛋白的NESGDPSSKST序列结合，导致SET与importinα结合显著减少，从而引起SET核输入障碍，滞留胞浆，显著抑制PP2A活性，并导致tau蛋白发生过度磷酸化，神经元树突损伤，LTP及学习和记忆的损伤。通过给予Tat-NESGDPSSKST肽段可以通过有效竞争性结合14-3-3β/δ来释放SET，使SET核输入正常而主要定位与胞核，减少对胞浆中PP2A的抑制，恢复PP2A活性，减少神经元树突损伤，恢复LTP及学习和记忆的损伤等。
　　第二部分 探讨14-3-3δ与CKII介导SET滞留胞浆的分子机制，进一步阐明AD发病机制。
　　背景：第一部分研究发现过表达14-3-3δ导致SET滞留在胞浆，并伴有SET Ser-9磷酸化现象。有研究发现 SET上游蛋白激酶 CKII在AD脑内上调，二聚体的14-3-3δ可募集CKII。为此设想：14-3-3δ在结合SET的同时，也俘获CKII，从而使得SET更容易成为CKII的底物被磷酸化，进一步引起磷酸化SET与importinα结合障碍，导致SET滞留胞浆。
　　目的：探讨14-3-3δ与CKII介导SET滞留胞浆的分子机制，进一步阐明AD发病机制。
　　方法：通过海马DG区注射AAV8-14-3-3δ病毒，感染C57小鼠，激光共聚集荧光显微镜下观察脑片SET的亚细胞定位，以及SET、14-3-3δ及CKIIα的分布与共定位。培养HEK293/tau细胞，转染pcDNA3.1+/14-3-3δ48 h后，通过免疫共沉淀方法检测SET、14-3-3δ及CKIIα的结合程度。使用CKII特异性抑制剂TBB（4,5,6,7-Tetrabromobenzotriazole）处理转染14-3-3δ的HEK293/tau细胞，检测SET Ser-9磷酸化变化，SET表达量变化，CKIIα表达量变化。已转染CKIIα的HEK293/tau细胞给予si14-3-3δ处理，检测SET Ser-9磷酸化变化，SET表达量变化，CKIIα表达量变化。通过丝氨酸/苏氨酸检测试剂盒(Promega, Cat.＃ V2460)测定PP2A活性。人工包装过表达CKIIα的AAV病毒感染C57小鼠，同时分别用AAV8-si14-3-3δ、AAV8-Ssi处理。通过条件恐惧实验，水迷宫实验来检测行为学的变化，激光共聚集荧光显微镜下观察脑片上SET蛋白的亚细胞定位。64位阵列系统检测活体脑片海马DG区到CA1区LTP变化，体外原代培养大鼠胚胎海马神经元检测神经元树突，树突棘等的变化，免疫印迹检测小鼠海马synaptotagmin，synaptophysin，synapsin1， phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)，NR1，NR2A和NR2B等突触蛋白及SET Ser-9磷酸化的变化。
　　结果：过表达14-3-3δ的AAV8病毒感染C57小鼠脑片上，可以观察到SET、CKIIα、14-3-3δ三者间可相互共定位，且过表达14-3-3δ动物脑内SET主要定位于胞浆。在HEK293/tau细胞株中，免疫共沉淀结果显示SET、CKIIα、14-3-3δ三者间相互结合，且过表达14-3-3δ组的结合程度显著增强。这些结果提示：14-3-3在结合SET的同时，也可募集CKIIα。已转染14-3-3δ的HEK293/tau细胞给予CKII抑制剂TBB处理后发现，SET Ser-9磷酸化程度显著降低；给予si14-3-3δ处理后发现，敲减14-3-3δ可导致SET Ser-9磷酸化程度降低。说明CKIIα通过14-3-3δ的募集促进对SET的磷酸化修饰。PP2A活性检测发现TBB处理可很好的恢复由于14-3-3δ引起的PP2A活性降低。人工包装过表达CKIIα的AAV8病毒感染C57小鼠，同时分别用AAV8-si14-3-3δ、AAV8-Ssi处理，条件恐惧、水迷宫实验实验发现si14-3-3δ处理可恢复小鼠学习和记忆能力。激光共聚集荧光显微镜下可观察到过表达CKIIα可促进SET滞留于胞浆，而si14-3-3δ可恢复SET的核输入。64位阵列系统检测活体脑片海马DG区到CA1区LTP变化，发现过表达CKIIα可以显著抑制LTP，体外原代培养大鼠胚胎海马神经元发现过表达CKIIα可导致神经元树突长度缩短，分支减少，树突棘密度减少等变化；免疫印迹实验检测发现在小鼠海马蛋白中，过表达CKIIα可导致synaptotagmin， synaptophysin， synapsin1， phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突触前蛋白减少，NR2A：NR2B比值变大， SET Ser-9显著磷酸化，si14-3-3δ处理可以有效恢复上述变化。
　　结论：14-3-3δ可同时结合CKIIα与SET，并促进CKIIα对SET Ser-9的磷酸化，进一步导致SET滞留胞浆，引起PP2A活性抑制、神经元树突损伤、学习和记忆的损伤。si14-3-3δ显著减少CKIIα与SET的结合，引起CKII磷酸化SET Ser-9程度降低，从而恢复PP2A活性、神经元树突损伤、学习和记忆的损伤。

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第一部分14-3-3β/ζ结合I2PP2A/SET蛋白N端序列致其在胞浆聚集

摘要

Abstract

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

创 新 点

参 考 文 献

第二部分14-3-3ζ募集CKIIα促进SET Ser-9磷酸化

摘要

Abstract

前言

材 料 与 方 法

结果

讨论

结论

创 新 点

参 考 文 献

综述

附录

致谢