第一部分阿尔茨海默病中I2PP2A/SET核运输障碍的机制研究;第二部分黄连素对花萼海绵诱癌素CA诱导的HEK293细胞毒性和tau蛋白过度磷酸化的保护作用及其机制

摘要

本研究分为二部分：
　　第一部分、阿尔茨海默病中I2PP2A/SET核运输障碍的机制研究
　　背景：
　　阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)患者脑中蛋白磷酸酯酶PP2A活性降低，并被认为是导致tau蛋白过度磷酸化促细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)形成的主要原因。然而，AD脑内参与调节PP2A活性的机制尚未明了。Li等从牛肾抽提物中纯化出两种热稳定蛋白I1PP2A（PHAP I）和I2PP2A（SET），二者均能特异且高效地抑制PP2A活性。在AD患者脑内，核蛋白SET水平显著增高，且主要分布在嗅球、海马、大脑皮质、尾壳核、丘脑等脑区；作为核蛋白， SET从核转运至胞浆，并发现与神经元胞浆内PP2A及异常过度磷酸化的tau蛋白共定位。上述研究说明AD患者脑内出现了胞浆SET异常聚积并且是tau蛋白过度磷酸化的关键上游机制。然而，核蛋白SET如何滞留并聚积于胞浆以及SET抑制PP2A活性的分子机制尚不清楚。亲核蛋白的核运输过程主要通过核定位信号(nuclear localization signal, NLS)和核输出信号(nuclear export signal, NES)来调节。其中，核定位信号NLS通常是亲核蛋白内具有一个带正电荷的肽核心（多聚赖氨酸），并且能保证整个蛋白质能够通过核孔复合体(Nuclear Pore Complex, NPC)被运到细胞核内的特殊的短肽氨基酸序列。核输出信号NES是指可被核孔复合体上的输出受体所识别，引导大分子从细胞核经NPC输出到细胞质的一段氨基酸序列，通常富含亮氨酸。本课题组近期研究发现：分别转染SET及携带外源性NLS的SET/NTF（N-Terminal Fragments, NTF即SET的N端片段，包含有在两个loxP位点间插入了外源性核定位信号NLS）于COS7细胞株，48h后，发现全长SET定位于核内、携带外源性NLS的SET/NTF片段也主要定位于细胞核内；但用Cre重组酶切除loxP位点间的NLS后，SET的N端片段转位于胞浆，且与tau共定位。这些结果提示：核定位信号NLS异常可能是导致SET核运输障碍的一个关键因素；内源性PP2A特异性抑制剂 SET高表达可能通过抑制PP2A活性及其下游因素在AD样神经病变及学习记忆障碍中发挥重要作用。磷酸化修饰是核运输的重要调节机制，尤其是NLS磷酸化修饰被认为是影响其与核输入蛋白结合形成核输入复合物的一个重要因素。通过磷酸氨基酸分析、HPLC和放射性序列分析鉴定，Ser-9确定为SET主要的磷酸化位点。巧合的是，以Ser-9为中心的一段结构域序列(6-10aa)AKVSKK富含赖氨酸(lysine,K)，与目前多个公认的富含赖氨酸(碱性氨基酸，易于锚定核输入蛋白)的核定位信号NLS序列KKXXKX或XKXXKK(X为其它氨基酸)一致。因此，此段结构域中Ser9的磷酸化可作为研究NLS调节SET核运输的一个重要靶点。作为NLS特征性的富聚赖氨酸，其中每一赖氨酸对NLS锚定核输入蛋白的贡献进而影响核蛋白输入的作用可能会有不同，从而影响NLS的功能。
　　目的：
　　探讨SET核运输障碍的调节机制以及SET对PP2A活性抑制的分子机制，进一步阐明AD发病机理和寻求有效药物开发的分子靶点。
　　方法：
　　利用人类最长（tau441）基因稳定转染人胚肾HEK293细胞，即HEK293/tau细胞。在37C含95％的空气和5％CO2饱和湿度培养箱中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293/tau细胞。磷酸化丝氨酸9位点SET多克隆抗体anti-SET(phospho S9) antibody rabbit polyclonal antibody由Abmart公司提供。Iqbal博士友情馈赠AD患者以及年龄匹配的正常组大脑皮层切片。利用免疫组织化学方法检测AD大脑皮层神经元SET丝氨酸ser9位点的磷酸化程度及其亚细胞定位。通过基因定点突变SET内丝氨酸Ser-9为非极性氨基酸丙氨酸(Ala, A)，即SET(S9A)和极性带负电荷氨基酸(Glu, E)，即SET(S9E)，分别携带His标签，模拟SET的持续非磷酸化与磷酸化；再分别突变His-SET此段序列中的碱性氨基酸赖氨酸Lys-7， Lys-10和Lys-11为中性氨基酸丙氨酸，分别转染SET及SET突变体于HEK293/tau细胞株，48h后，通过激光共聚焦检测上述突变SET的亚细胞分布。通过免疫共沉淀方法检测相比于野生型SET，SET突变体与核输入蛋白Importin的结合程度。通过丝氨酸/苏氨酸检测试剂盒(Promega, Cat.＃ V2460)测定SET磷酸化修饰对PP2A活性的影响；利用免疫印迹方法检测SET磷酸化修饰后对tau蛋白Ser396, Thr231, Ser262, Thr205, Ser214, Ser404和Ser199位点磷酸化程度的影响。为了进一步明确6AKVSKK11序列是SET的核定位信号，并且在SET核运输中起到关键作用，通过人工合成Tat-NLS(Tat-AAKVSKKE)肽段，利用激光共聚集荧光显微镜观察Tat-NLS对内源性SET核定位及细胞内分布的影响。
　　结果：
　　本实验中我们发现AD大脑皮质神经元中SET丝氨酸Ser-9位点发生磷酸化，并且磷酸化SET在胞浆中发生聚集。基因定点突变SET内丝氨酸Ser-9为His-SET(S9A)和His-SET(S9E)，分别模拟SET的持续非磷酸化与磷酸化。然后分别转染野生型SET(His-SET WT)及SET突变体His-SET(S9A)和His-SET(S9E)于HEK293/tau细胞株，48h后，发现野生型SET及SET突变体His-SET(S9A)定位于核内，然而His-SET(S9E)，即模拟SET Ser-9持续磷酸化的SET突变体，大部分转位于胞浆，并在胞浆中滞留。利用核蛋白提取试剂盒分离提取胞浆胞核蛋白，发现核蛋白中SET突变体His-SET(S9E)的量明显减少，而在胞浆蛋白中明显增加；通过免疫共沉淀方法检测到模拟Ser-9磷酸化修饰的His-SET(S9E)与importinα，importinβ的结合减少，引起SET核输入复合物形成障碍，导致SET入核困难而滞留于胞浆。作为SET磷酸化修饰的上游激酶酪蛋白激酶Ⅱ（Casein Kinase II, CKII）水平在AD脑内上调，为进一步探讨外源性刺激对内源性SET磷酸化修饰及其亚细胞分布的影响。我们在细胞水平上调CKⅡ表达水平，结果显示：CKⅡ可以显著磷酸化内源性SET，并且磷酸化修饰后SET在胞浆中大量聚集。因此，CKⅡ可能成为AD治疗的一个新的药物靶点。我们还观察到SET丝氨酸Ser-9位点磷酸化修饰后与PP2A催化亚基C结合更强，从而显著抑制PP2A活性，并导致tau蛋白在Ser396, Thr231, Ser262, Thr205, Ser214, Ser404, PHF-1和Ser199位点发生过度磷酸化。为明确以Ser-9为中心的此段结构域序列(6-10aa)AKVSKK可能为SET的核定位信号，我们通过基因定点突变SET此段结构域上的赖氨酸，发现仅His-SET(K11A)突变体在胞浆中出现滞留现象，免疫共沉淀的结果显示His-SET(K11A)突变体与importinα，importinβ的结合减少，确定Lysine11对SET锚定核输入蛋白的贡献最大，是影响SET入核的功能氨基酸。固相合成并纯化肽段Tat-NLS(Tat-AAKVSKKE)，将肽段加入到HEK293/tau细胞中孵育48小时，激光共聚集荧光显微镜下观察到Tat-NLS可以竞争性抑制内源性SET与核输入蛋白importin结合，从而导致内源性SET入核障碍而滞留胞浆。上述结果提示6AKVSKK11是SET的核定位信号；位于SET核定位信号的Ser-9磷酸化修饰导致SET滞留胞浆，进而PP2A活性并引起下游AD样病理学变化。
　　结论：
　　1. AD患者脑内神经元SET Ser-9位点显著磷酸化是导致SET滞留胞浆的关键原因；
　　2.6AKVSKK11序列是SET的核定位信号，其中赖氨酸Lysine11是SET核定位信号上的功能氨基酸。
　　第二部分、黄连素对花萼海绵诱癌素CA诱导的HEK293细胞毒性和tau蛋白过度磷酸化的保护作用及其机制
　　背景及目的：
　　黄连素，又称小檗碱(Berberine, BR)，是从中草药黄连等植物中提取分离得到的一类异喹啉类生物碱，属季铵类化合物。黄连素具有多种保健作用，并拥有各种生化和药理活性，包括抗腹泻，抗心律失常和抗肿瘤等活性。近年来，药效学研究发现小檗碱对治疗AD有潜在作用，包括对阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)模型大鼠空间学习记忆障碍的改良；改变β-淀粉样蛋白前体（AβPP）加工处理过程和减少Aβ的分泌；通过降低海马神经元细胞内游离Ca2+从而减少Aβ诱导的细胞凋亡；以及具有抗胆碱酯酶活性。此外，黄连素还能在HCT-116细胞调节GSK-3β活性。根据以上报道，黄连素可能是一个治疗AD的潜在药物。由过度磷酸化的微管相关蛋白tau蛋白构成的皮层神经原纤维缠结NFTs数量与阿尔茨海默病的临床痴呆程度呈正相关，提示tau蛋白过度磷酸化促NFTs形成在AD发病中起关键作用。到目前为止，受累神经元内蛋白激酶/蛋白磷酸酶动态平衡失调是导致AD样tau蛋白异常过度磷酸化的直接原因。其中糖原合酶激酶-3(GSK-3）和蛋白磷酸酶(PP）-2A，分别是最有关联的激酶和磷酸酶。然而，到现在为止，一直没有研究报道黄连素是否影响tau蛋白磷酸化。为此，本研究探讨了在人胚肾转tau细胞（HEK293/tau）中小檗碱对花萼海绵诱癌素（Calyculin A, CA, PP2A和PP1的抑制剂）诱导tau过度磷酸化的影响及其相关酶活性的变化。
　　方法：
　　利用人类最长（tau441）基因稳定转染人胚肾HEK293细胞，即HEK293/tau细胞。在37?C含95％的空气和5％CO2饱和湿度培养箱中，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293/tau细胞。在6孔培养板中培养24小时后，无血清培养基稀释的2.5nM calyculin A预处理细胞12小时，然后分别给予0，5，10，20，50，或100微克/毫升小檗碱处理细胞24小时。用CCK-8细胞计数试剂盒来测定细胞活力和小檗碱的最佳剂量。随后，通过显微镜成像，Hoechst33342染色，TUNEL法，流式细胞仪和caspase-3活性测定来观测黄连素对calyculin A诱导的形态学变化和HEK293/tau细胞凋亡的影响。利用免疫印迹来检测20微克/毫升小檗碱对calyculin A诱导的Ser198/199/202（Tau-1位点）， Ser396，Ser404，Thr205和Thr231等位点tau蛋白过度磷酸化的影响，以及糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）Tyr216和Ser9的磷酸化程度。采用丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性检测试剂盒（Promega公司，货号V2460）来测定PP2A活性。通过测定丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性来检测小檗碱对calyculin A诱导氧化应激的保护作用。
　　结果：
　　1)20μg/ml小檗碱作用人胚肾293/tau细胞24小时可显著减少2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的细胞死亡，而仅给予小檗碱处理对正常细胞无任何影响；
　　2)20μg/ml小檗碱可显著减少2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的细胞形态改变及凋亡；
　　3)20μg/ml小檗碱可显著降低2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的tau蛋白Ser198/199/202(Tau-1位点), Ser396, Ser404, Thr205,和Thr231位点过度磷酸化程度；
　　4)20μg/ml小檗碱可显著逆转2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的PP-2A活性下降和GSK-3β活性增强，研究其作用机制发现GSK-3β在Tyr216位点磷酸化程度明显下降而Ser9位点磷酸化程度明显增强；
　　5)20μg/ml小檗碱可通过降低丙二醛水平和增加超氧化物歧化酶活性从而保护2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的氧化应激。
　　结论:小檗碱能减轻由花萼海绵诱癌素CA诱导的人胚肾293/tau细胞毒性作用;可能通过恢复蛋白磷酸酶PP2A活性和下调糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)活性降低tau蛋白过度磷酸化水平;并且小檗碱可通过降低丙二醛水平和增加超氧化物歧化酶活性从而保护2.5nM花萼海绵诱癌素CA诱导的氧化应激。以上结果提示小檗碱可能是一种治疗阿尔茨海默病的潜在药物。

目录

封面

声明

目录

第一部分阿尔茨海默病中I2PP2A/SET核运输障碍的机制研究

中文摘要

英文摘要

主要英文缩略词表

前言

材料与方法

一、主要实验仪器

二、主要实验试剂

三、抗体

四、细胞培养

五．基因单点突变

六．质粒DNA的转化、扩增、提取及凝胶电泳1. 质粒转化大肠杆菌

七．免疫组织化学检测方法（Immunohistochemistry，IHC)

八．免疫荧光细胞化学技术

九．细胞核蛋白与细胞浆蛋白分离提取方法

十．免疫共沉淀检测技术（Immunoprecipitation, IP）

十一．免疫印迹技术

十二、PP2A酶活性测定 (Serine Threonine Phosphatase Assay System) 1. 染色液制备

十三、图像分析和统计分析

结果

一．AD患者脑内核蛋白SET丝氨酸9位点发生磷酸化且在胞浆中大量聚积

二．核蛋白SET丝氨酸9位模拟磷酸化对SET核输入的影响

三．上调酪蛋白激酶CKII对SET亚细胞分布的影响

四．核蛋白SET磷酸化修饰显著降低PP2A活性并导致tau蛋白过度磷酸化

五．结构域序列 6AKVSKK11为SET的核定位信号

讨论

结论

创 新 点

参考文献

第二部分黄连素对花萼海绵诱癌素CA诱导的HEK293细胞毒性和tau蛋白过度磷酸化的保护作用及其机制

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

一、主要实验仪器

二、主要实验试剂

三、抗体

四、细胞培养

五．显微镜成像

六．Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞活力检测方法

七．一步法TUNEL细胞凋亡原位检测

八．Caspase 3活性检测

九．Annexin V/PI细胞凋亡检测1. 反应原理

十．免疫印迹技术

十一、PP2A酶活性测定 (Serine Threonine Phosphatase Assay System)参见第一部分。

十二、丙二醛含量与超氧化物歧化酶活性测定

十三、图像分析和统计分析

结果

一．小檗碱对花萼海绵诱癌素CA诱导的细胞活力下降的影响

二．小檗碱对花萼海绵诱癌素CA诱导的细胞形态改变和凋亡的治疗作用

三．小檗碱对花萼海绵诱癌素CA诱导的tau过度磷酸化的影响

四．小檗碱对花萼海绵诱癌素CA诱导的PP-2A活性抑制和GSK-3β活性增强的影响

讨论

结论

参考文献

综 述阿尔茨海默病中蛋白磷酸酶2A活性下调的机制探讨

参考文献

附录

致谢