过表达胆绿素还原酶的巨噬细胞对小鼠缺血再灌注诱导急性肾脏损伤后纤维化的影响

摘要

第一部分、研究胆绿素还原酶与巨噬细胞的关系
　　目的：探讨巨噬细胞分化模型中BVR的表达，肾脏缺血再灌注模型中BVR阳性的巨噬细胞的表达情况。
　　方法：体外培养L929细胞三天，收集L929细胞上清，用此培养基来体外培养小鼠骨髓来源巨噬细胞7天，分别用LPS100ng/ml和IFN-γ100ng/ml、IL-410ng/ml和IL-1310ng/ml刺激24小时后收集细胞。用Western blot检测INOS和ARG-1的表达；用流式细胞术检测CD45、F4/80、CD11b、CD86和DECTIN-1的表达；用RT-PCR检测INOS、ARG-1、TNF-α、FIZZ1、YM-1、MMR和TGF-β的表达来判断M1和M2的模型是否建立成功，然后在巨噬细胞模型中检测BVR的表达。同时在RAW264.7细胞系构建的巨噬细胞分化模型中检测BVR的表达。并在肾脏缺血再灌注手术5天和10天后用流式细胞术检测血液、骨髓和肾脏中BVR阳性的巨噬细胞表达的情况。
　　结果：⑴Western blot发现LPS和IFN-γ组（M1巨噬细胞）INOS表达增加，IL-4和IL-13组（M2巨噬细胞）ARG-1表达增加；⑵流式细胞术发现LPS和IFN-γ组巨噬细胞中CD86表达增加，IL-4和IL-13组巨噬细胞中DECTIN-1表达增加；⑶RT-PCR发现LPS和 IFN-γ组巨噬细胞中INOS和TNF-α表达增加；IL-4和IL-13组巨噬细胞中ARG-1、YM-1、FIZZ1、MMR和TGF-β表达增加；⑷RT-PCR发现在小鼠骨髓来源的巨噬细胞和RAW264.7细胞系巨噬细胞分化模型中BVR均在M1表达降低，在M2中表达增加；⑸在缺血再灌注手术5天和10天后，BVR阳性的巨噬细胞在血液、骨髓和肾脏中表达都较对照组增加。
　　结论：⑴LPS和IFN-γ，IL-4和IL-13刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞构建M1和M2模型成功；⑵BVR在小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠单核巨噬细胞系构建的巨噬细胞分化模型中均在M1中表达降低，在M2中表达增加；⑶BVR阳性的巨噬细胞在血液、骨髓和肾脏中均广泛存在。
　　第二部分、过表达胆绿素还原酶的巨噬细胞对急性肾损伤后肾脏
　　目的：通过重度肾脏缺血再灌注损伤建立急性肾损伤后肾脏纤维化，探讨过表达BVR巨噬细胞在急性肾损伤后肾脏纤维化中的作用。
　　方法：将6周大小的C57BL/6雄性小鼠分为假手术组、手术组、注射过表达BVR细胞手术组和注射腺病毒阴性对照手术组。应用FHC温控系统建立重度肾脏缺血再灌注模型。在37℃条件下，假手术组开腹30分钟；手术组夹闭左侧肾脏30分钟，右侧肾脏不处理，术后一天通过尾静脉注射过表达BVR的巨噬细胞或对照腺病毒巨噬细胞（106/只），注射细胞5天后取标本，用PAS染色观察形态学变化，Masson和天狼星红染色观察纤维化情况，组化检测α-SMA、collagenIV和PDGFR-β，Western blot检测α-SMA、PDGFR-β和Vimentin。
　　结果：注射细胞后1天取小鼠血液和左右肾脏标本，流式细胞术检测GFP表达，发现GFP阳性巨噬细胞在手术侧肾脏明显增加（16.47％±3.66%），血液中也有少量GFP阳性巨噬细胞（2.48%±2.54%）。注射细胞5天后病理检测发现，小鼠管腔扩大管壁变薄，肾间质炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞的脱落坏死在注射过表达BVR巨噬细胞组最为明显；组化结果显示肾脏α-SMA、collagenIV和PDGFR-β表达在过表达BVR巨噬细胞注射组表达最多；Western blot结果显示α-SMA、PDGFR-β和Vimentin在过表达BVR巨噬细胞注射组表达升高。
　　结论：⑴注射GFP阳性巨噬细胞后细胞主要存在于缺血再灌注模型的手术侧肾脏；⑵注射过表达BVR巨噬细胞肾脏纤维化和肾脏损伤与腺病毒阴性对照细胞注射相比有所加重。
　　第三部分、过表达胆绿素还原酶巨噬细胞对敲除巨噬细胞后急性肾损伤肾脏纤维化的影响
　　目的：通过脂质体敲除巨噬细胞和重度肾脏缺血再灌注损伤建立巨噬细胞敲除急性肾损伤后肾脏纤维化，探讨过表达BVR巨噬细胞在巨噬细胞敲除后肾脏纤维化中的作用。
　　方法：将6周大小的C57BL/6雄性小鼠分为假手术组、敲除巨噬细胞手术组、注射过表达BVR细胞敲除巨噬细胞手术组和注射腺病毒阴性对照手术组。通过尾静脉注射clodronate liposomes200μl两天后，应用FHC温控系统建立重度肾脏缺血再灌注模型。在37℃条件下，假手术组开腹30分钟；手术组夹闭左侧肾脏30分钟，右侧肾脏不处理，术后一天通过尾静脉注射过表达BVR的巨噬细胞或对照腺病毒巨噬细胞（106/只），注射细胞5天后取标本，用PAS染色观察形态学变化，Masson和天狼星红染色观察纤维化情况，组化检测α-SMA、collagenIV和PDGFR-β，Western blot检测α-SMA、PDGFR-β和Vimentin，RT-PCR检测COL1α1和Kim-1。
　　结果：注射细胞5天后病理检测发现，小鼠管腔扩大管壁变薄，肾间质炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞的脱落坏死在注射过表达BVR细胞敲除巨噬细胞手术组最为明显；组化结果显示肾脏α-SMA、collagenIV和PDGFR-β表达在过表达BVR细胞敲除巨噬细胞手术组表达最多；Western blot结果显示α-SMA、PDGFR-β和Vimentin在过表达BVR细胞敲除巨噬细胞手术组表达升高。RT-PCR结果显示COL1α1和Kim-1在过表达BVR细胞敲除巨噬细胞手术组表达升高。
　　结论：注射过表达BVR巨噬细胞肾脏纤维化和肾脏损伤与腺病毒阴性对照细胞注射相比有所加重。
　　第四部分、过表达胆绿素还原酶巨噬细胞的功能
　　目的：探讨过表达BVR小鼠巨噬细胞的功能。
　　方法：分离培养原代小鼠骨髓来源的巨噬细胞和小鼠巨噬细胞系RAW264.7，腺病毒包装的BVR基因转染骨髓来源的巨噬细胞，Western blot和RT-PCR检测转染效率，然后用RT-PCR检测转染后细胞INOS、ARG-1、TNF-α和IL-6的表达水平。分别给予GM-CSF100ng/ml和50ng/ml、M-CSF100ng/ml和50ng/ml刺激小鼠骨髓来源的巨噬细胞24小时，RT-PCR检测BVR表达，根据BVR表达情况确定GM-CSF和M-CSF刺激浓度。细胞转染之后分别给予LPS1μg/ml、100ng/ml、GM-CSF100ng/ml和M-CSF100ng/ml刺激过表达BVR巨噬细胞24小时，用RT-PCR检测细胞INOS、ARG-1、TNF-α和IL-6的表达水平。
　　结果：在小鼠骨髓来源巨噬细胞和小鼠巨噬细胞系RAW264.7中均发现BVR过表达组巨噬细胞INOS、ARG-1、TNF-α和IL-6表达增加；同时经过LPS1μg/ml和100ng/ml刺激24小时后，BVR过表达组巨噬细胞INOS、TNF-α和IL-6表达增加更加明显，在LPS1μg/ml组更加明显；经GM-CSF100ng/ml、50ng/ml、M-CSF100ng/ml和50ng/ml分别刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞24小时后，RT-PCR检测发现 BVR在GM-CSF100ng/ml组降低最明显，而在M-CSF100ng/ml组升高最明显，故选用100ng/ml浓度刺激过表达BVR巨噬细胞，GM-CSF刺激过表达BVR的巨噬细胞促进INOS、TNF-α和IL-6表达增加，而M-CSF刺激BVR过表达巨噬细胞却没有这个作用。
　　结论：⑴过表达BVR巨噬细胞INOS、TNF-α和IL-6表达增加，LPS刺激过表达BVR的巨噬细胞促进INOS、TNF-α和IL-6表达；⑵GM-CSF使过表达BVR的巨噬细胞促进INOS、TNF-α和IL-6表达增加，而M-CSF没有该作用。

目录

声明

第一部分中文摘要

第一部分 英文摘要

第二部分 中文摘要

第二部分英文摘要

第三部分 中文摘要

第三部分 英文摘要

第四部分 中文摘要

第四部分 英文摘要

前言

参考文献

第一部分正文研究胆绿素还原酶与巨噬细胞的关系

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分正文过表达胆绿素还原酶的巨噬细胞对急性肾损伤后肾脏纤维化的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分正文过表达胆绿素还原酶巨噬细胞对敲除巨噬细胞后急性肾损伤肾脏纤维化的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分正文过表达胆绿素还原酶巨噬细胞功能

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

总结

综述：巨噬细胞和树突状细胞在肾脏中的作用

中英文主要缩略词

致谢