头孢拉定通过靶向TOPK蛋白激酶抑制SUV诱导的皮肤炎症

摘要

目的：由日光中的紫外线（SUV）诱导的皮肤炎症和皮肤癌症极大地威胁着人类的健康。SUV主要通过激活p38和JNKs，引起皮肤炎症。其中，TOPK为p38和JNKs的上游激酶，在SUV诱导的皮肤炎症过程中扮演着重要角色。因此我们期望寻找TOPK特异性抑制剂，通过抑制TOPK蛋白激酶，进而缓解SUV诱导的皮肤炎症。
　　方法：
　　1、收集临床数据，用HE，IHC检测病人皮肤病理改变及TOPK，p-p38，p-JNKs的表达情况。
　　2、在 HaCaT和 JB6细胞中，用 Western blot检测 SUV诱导的p-p38，p-JNKs和H2AX的表达情况。
　　3、在HaCaT细胞系中，用慢病毒沉默TOPK，检测SUV对p-p38、p-JNKs和H2AX表达情况的影响。
　　4、分子结合模型预测头孢拉定和TOPK的结合情况。
　　5、体外结合实验检测头孢拉定和TOPK的结合情况。
　　6、体外激酶实验检测头孢拉定对TOPK的抑制情况。
　　7、在HaCaT和JB6细胞中，用MTS检测头孢拉定对细胞活性的影响；用Western blot检测头孢拉定对 SUV诱导的TOPK下游信号通路的影响；同时ELISA检测炎症相关因子的变化。
　　8、在Balb/c鼠中，用HE检测头孢拉定对SUV诱导的小鼠皮肤病理变化的影响；用 IHC检测 TOPK下游因子 p-p38、p-JNKs、γ-H2AX的表达情况；用ELISA检测相关炎症因子的变化。
　　结果：
　　1、临床数据表明，在日光性皮炎病人病灶组织中，TOPK，p-p38，p-JNKs高表达。
　　2、在HaCaT和JB6细胞中，SUV以剂量和时间依赖的方式诱导p-p38和p-JNKs和γ-H2AX的表达。
　　3、在沉默TOPK的HaCaT细胞中，沉默TOPK抑制SUV诱导的p-p38、p-JNKs和γ-H2AX的表达。
　　4、分子结合模型表明，头孢拉定可以直接和TOPK结合。
　　5、体外结合实验进一步证实，头孢拉定可以结合TOPK。
　　6、体外激酶实验表明，头孢拉定以浓度依赖的方式抑制TOPK的活性。
　　7、在HaCaT和JB6细胞中，2 mM头孢拉定对二者的活性没有明显影响，头孢拉定以浓度和时间依赖的方式抑制SUV诱导的p-TOPK，p-p38，p-JNKs，p-ERK1/2，NF-κB p65，p-NF-κB p65和γ-H2AX的表达。ELISA结果表明，头孢拉定抑制SUV诱导的炎症因子TNF-α和IL6的分泌。
　　8、动物试验表明，头孢拉定可以明显减轻SUV诱导的皮肤病理改变，抑制SUV诱导的p-p38, p-JNKs和γ-H2AX的表达，并且抑制SUV诱导的炎症因子TNF-α和IL6的分泌。
　　结论：头孢拉定可以通过抑制TOPK的活性及其下游信号通路，抑制SUV诱导的皮肤炎症。

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英语缩略词汇

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前言

材料和方法

1.实验仪器、试剂及其配制

1.1实验仪器及材料

1.2 主要试剂

1.3 主要试剂的配制

2、主要设计思路

3、主要试验方法

3.1 SUV模型的建立

3.2 细胞培养

3.3 MTS分析

3.4 SUV和头孢拉定预处理HaCaT和JB6细胞

3.5蛋白的提取和定量

3.6免疫印迹法（Western blot）

3.7 GST-H2AX融合蛋白的细菌表达和纯化

3.8 体外激酶分析

3.9分子结合模型分析

3.10 体外结合试验 （CNBr-sepharose 4B banding 实验）

3.11 动物研究

3.12 免疫组化（IHC）

3.13 酶联免疫吸附实验（ELISA）

3.14 图像分析系统对条带进行灰度分析

3.15 统计学分析

结果

1. TOPK，p-p38 和p-JNKs 在人日光性皮炎中高表达

2. 在HaCaT和JB6细胞中，SUV以剂量和时间依赖的方式诱导p38和JNKs的磷酸化

3. 在HaCaT细胞中，沉默TOPK可以抑制SUV引起的p38和JNKs的磷酸化

4. 头孢拉定直接结合TOPK，并且抑制TOPK的活性。

5. 在HaCaT和JB6细胞中，头孢拉定以浓度和时间依赖的方式下调SUV诱导的TOPK下游信号通路的激活，并且抑制SUV诱导的炎症因子的分泌

6. 头孢拉定抑制SUV诱导的DNA损伤

7. 头孢拉定抑制SUV诱导的Babl/c鼠的皮肤炎症

讨论

参考文献

综述: 蛋白激酶和转录因子的激活在SUV诱导的皮肤疾病中的作用

附录

致谢