EGFR激活在脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤发病机制中的作用

摘要

本文主要从以下几部分进行论述：
　　第一部分 脂多糖诱导小鼠急性肺损伤模型的建立及EGFR、磷酸化EGFR在肺组织中的表达
　　目的：建立脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤（ALI）模型，并检测肺组织中表皮生长因子受体（EGFR）、磷酸化表皮生长因子受体（p-EGFR）的表达。
　　方法：选择6-8周，体重18-22克的C57BL/6雄性小鼠作为研究对象，实验组（n=6）使用气管内滴注法给予LPS（2mg/kg）诱导小鼠ALI模型，对照组（n=6）使用同等剂量的生理盐水气管内滴注，24h后收集肺组织和肺泡灌洗液（BALF），肺组织切片Hematoxylin-eosin(HE）染色评估急性肺损伤程度，石蜡切片免疫荧光染色评估EGFR、p-EGFR表达水平，Western Blot检测EGFR、p-EGFR蛋白质表达水平。
　　结果：实验组小鼠HE染色可见LPS诱导小鼠组有明显的急性肺损伤表现，对照组未见明显损伤；免疫荧光染色可见LPS诱导的ALI组EGFR阳性的细胞数量未见明显变化，但p-EGFR阳性的细胞数量明显增加（p<0.05），而对照组p-EGFR与EGFR阳性细胞的数量未见明显差异（p>0.05）；Western Blot结果显示实验组及对照组均可见EGFR表达，两组表达水平无明显差异，但LPS诱导的ALI组p-EGFR蛋白质表达水平明显增加（p<0.05)。
　　结论：在LPS诱导的小鼠ALI模型中，肺组织损伤严重，并且p-EGFR蛋白表达水平明显增强。
　　第二部分 EGFR抑制剂Erlotinib在脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤模型中的作用
　　目的：检测EGFR抑制剂Erlotinib在LPS诱导的小鼠ALI模型中的影响。
　　方法：选择6-8周，体重18-22克的C57BL/6雄性小鼠作为研究对象，随机分为6组，每组6只。空白对照组（Control）小鼠不予以任何处理；阳性对照组小鼠采用100mg/kg剂量的erlotinib灌胃（ER）；实验组小鼠采用2mg/kg的LPS气管内滴注（LPS）；药物处理组小鼠分为三组，依次为：10mg/kg erlotinib剂量灌胃、1小时后采用2mg/kg的LPS气管内滴注（ER10+LPS），25mg/kg erlotinib剂量灌胃、1小时后采用2mg/kg的LPS气管内滴注（ER25+LPS），100mg/kg erlotinib剂量灌胃、1小时后采用2mg/kg的LPS气管内滴注（ER100+LPS）。所有组小鼠均在LPS处理24小时后收集肺组织和肺泡灌洗液（BALF），肺组织切片HE染色评估急性肺损伤程度并进行肺组织损伤评分（Lung injury scoring system，LISS）评估，石蜡切片免疫荧光染色观察Gr-1阳性的中性粒细胞数量，显微镜下计数BALF中总细胞数量，BCA法评估BALF中总蛋白质水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BALF中IL-1β表达水平。
　　结果：肺组织损伤评分表明，与空白对照组及阳性对照组相比，LPS诱导的ALI中LISS评分明显升高（p<0.05），而使用erlotinib处理组后，LISS评分下降（p<0.05），并且呈现erlotinib剂量依耐性。Gr-1免疫荧光表明LPS诱导ALI组有明显中性粒细胞聚集（p<0.05），erlotinib处理后Gr-1阳性的细胞数量减少（p<0.05）。总细胞计数显示，LPS诱导ALI组BALF中细胞数量明显增多（p<0.05），erlotinib处理后细胞数量减少（p<0.05）。BCA法评估BALF总蛋白含量表明，erlotinib能够抑制LPS诱导的ALI中总蛋白的渗出水平（p<0.05）。ELISA检测BALF中IL-1β发现，使用erlotinib处理后IL-1β分泌水平均有下降（p<0.05）。
　　结论：Erlotinib能够减缓LPS诱导的肺组织损伤程度，减少肺组织中中性粒细胞募集及肺组织蛋白和细胞的渗出，并能抑制炎症因子IL-1β的分泌。
　　第三部分 EGFR抑制剂Erlotinib减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的作用机制研究
　　目的：探究Erlotinib在减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤中的作用机制。
　　方法：选择6-8周，体重18-22克的C57BL/6雄性小鼠作为研究对象，随机分为6组，每组6只。空白对照组（Control）小鼠不予以任何处理；阳性对照组小鼠采用100mg/kg剂量的erlotinib灌胃（ER）；实验组小鼠采用2mg/kg的LPS气管内滴注（LPS）；药物处理组小鼠分为三组，依次为：10mg/kg erlotinib剂量灌胃、1小时后采用2mg/kg的LPS气管内滴注（ER10+LPS），25mg/kg erlotinib剂量灌胃、1小时后采用2mg/kg的LPS气管内滴注（ER25+LPS），100mg/kg erlotinib剂量灌胃、1小时后采用2mg/kg的LPS气管内滴注（ER100+LPS）。所有组小鼠均在LPS处理24小时后收集肺组织，Western Blot检测肺组织中Toll-样受体4（TLR4）、p65、p-p65、IL-1β、TNF-α，及EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK、AKT、p-AKT蛋白质表达水平。
　　结果：与空白对照组及阳性对照组相比，LPS诱导的ALI组中，p-p65、p-EGFR、p-ERK、p-AKT表达水平明显升高（p<0.05）；在使用erlotinib灌胃处理后，p-p65、p-EGFR、p-ERK、p-AKT表达水平较LPS诱导的ALI组明显降低（p<0.05）。而TLR4、EGFR、ERK、AKT表达水平无统计学差异（p>0.05）。IL-1β、TNF-α在ALI模型中表达增加，但在erlotinib处理后，其表达水平降低（p<0.05）。
　　结论：Erlotinib抑制EGFR信号通路激活进而减缓LPS诱导的ALI小鼠的肺组织损伤，并且TLR4信号通路参与这一过程。