Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体的制备及其构象稳定性的分析

摘要

HLA-A2是一种经典的MHC I类分子，含两条多肽链：重链（H链或α链,包括α1、α2和α3结构域）与轻链（L链或β2m链），其中β2m非共价结合于α3结构域。抗原肽结合于由α1、α2形成的抗原结合槽，当抗原肽与MHC分子结合形成pMHC，可被APC呈递给CD8+T细胞表面的TCR识别，引起特异性细胞免疫应答。α链、β2m链和抗原肽三者的稳定结合，对维持MHCⅠ类分子天然构象及发挥生物功能具有重要的意义。因此，我们将抗原肽、α链、β2m链稳定连接，以期获得不易解离的pMHC复合物，保证其结构与功能的完整。研究证实pMHC单体与TCR的亲和力较低，不能有效的激活CTL，于是后期研究通过将pMHC多聚化来提高抗原与TCR的亲和力，并发现可溶性pMHC二聚体可与TCR高亲和力结合。
　　前期研究表明，非共价连接的HLA-A2二聚体，具有检测与调节CTL的功能。由于非共价连接具有可逆性，不能耐受SPA纯化的酸性环境，故本室曾通过两个柔性连接肽(G4S)3将AFP抗原肽、β2m链与α链三者共价连接，并在CHO细胞中表达出共价连接的AFP/HLA-A2二聚体，但是该二聚体经SPA纯化后，其构象仍会改变而影响生物学活性。故本课题灵活采用共价与非共价连接方式，首先将AFP抗原肽通过(G4S)3共价连接至β2m链，再通过转录因子Fos和Jun形成的亮氨酸拉链结构将AFP-(G4S)3-β2m链以疏水结合作用非共价连接至α链，使抗原肽稳定加载至融合的HLA-A2/IgG1-Fc单体上，两个pMHC单体借助Fc段的链间二硫键连接形成Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体，以便后续可经SPA纯化得到纯度较高的正确构象二聚体，旨在提高pMHC二聚体与TCR的亲和力，从而高效扩增pMHC特异性的同种反应性T细胞。本研究主要内容与结果如下：
　　一、Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体的制备
　　为了构建pFastBacTMDual＋［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］表达质粒，选用本室保存的具有P10和Ph两个启动子的pFastBacTMDual空质粒为载体，将扩增所获的基因片段分别插入该载体两侧启动子下游。以本室前期构建的质粒pFastBacTMDual+［DR15/IgG1-Fc］为模板，分别扩增出转录因子Fos和Jun序列以及IgG1-Fc基因；以Invitrogen公司合成的pMD19-T+AFP-(G4S)3-β2m质粒作为模板，扩增出AFP-(G4S)3-β2m基因片段；应用人HLA-A2特异性引物从T2细胞中扩增HLA-A2(α1-α3)。再通过重叠PCR方法，分别将AFP-(G4S)3-β2m与Jun和HLA-A2与Fos基因片段连接。最后通过酶切位点将AFP-(G4S)3-β2m-Jun融合基因插入P10启动子下游，将HLA-A2-Fos、IgG1-Fc融合基因依次插入Ph启动子下游，获得目的质粒pFastBacTMDual＋［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］。经过特异性引物对各基因片段的PCR鉴定、限制性内切酶的酶切鉴定和碱基序列测定均证实目的基因按照正确的顺序完全插入了质粒。
　　pFastBacTMDual＋［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］重组质粒在大肠杆菌 DH10BacTM辅助质粒转座酶的作用下，转化入杆状病毒穿梭质粒，形成Bacmid+［AFP-(G4S)3-β2m-Jun］+［HLA-A2-Fos/IgG1-Fc］,将 PCR鉴定正确的重组Bacmid DNA转染至昆虫细胞SF9中，在转染成功的细胞上清中即可表达Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体。收获此上清，其中含成熟病毒颗粒，继续感染正常SF9细胞，用构像依赖性抗体W6/32进行ELISA检测每一代上清中Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体的构象与分泌水平，结果证实获得了正确构像的融合蛋白，且感染后第五代的SF9上清中Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体表达量最高。大量收集感染第五代病毒的SF9上清，通过Western-Blot鉴定由Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2单体的分子量约77KD，与预期相符。最后通过 FITC-BB7.2抗体流式细胞术检测，结果示 Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体与HLA-A2阴性个体的单核细胞有一定的结合率。
　　二、Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体与共价连接的AFP/HLA-A2二聚体的构象稳定性分析
　　虽然Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体与共价连接的AFP/HLA-A2二聚体都含有IgG1-Fc片段，理论上都可用金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）进行纯化。但前期实验发现共价连接的AFP/HLA-A2二聚体在洗脱液（pH3.0的0.1M甘氨酸）的酸性环境中易发生β2m脱落，破坏其完整结构。为了解决SPA纯化导致构象严重丢失的问题，本试验采用不易受pH等环境影响的亮氨酸拉链结构将AFP-(G4S)3-β2m和α链连接，并通过BEVS表达出Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体。将Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体与共价连接的AFP/HLA-A2二聚体经SPA纯化后的构象变化做对比，发现大部分共价连接的AFP/HLA-A2二聚体中β2m脱落，导致该二聚体构象缺失（构象完整率：12.3％±3.26%，n=3）；而大部分Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体却可保持构像的完整（构象完整率：71.24%±12.1%,n=3）。说明在酸性环境中，Fos-Jun形成的亮氨酸拉链结构比(G4S)3更稳定，Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体可经SPA有效纯化并保持其构象的完整性。
　　本研究成功制备了由Fos-Jun稳定连接的AFP/HLA-A2二聚体，为诱导产生同种pMHC限制性T细胞奠定了基础。

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前言

材料与方法

材料

方法

结果

一、 Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体的制备

二、 流式检测Fos-Jun连接AFP/HLA-A2二聚体的功能

三、 分析Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体与共价连接AFP/HLA-A2二聚体的构象稳定性

讨论

一、Fos和Jun连接的AFP/HLA-A2 二聚体的制备

二、Fos-Jun连接的AFP/HLA-A2二聚体的构象稳定性分析

小结

参考文献

综述

致谢