hCD1d二聚体的制备及其在纯化过程的构象稳定性分析

摘要

CD1d是一种MHCI类分子类似物，与MHCI类分子主要提呈抗原肽不同，CD1d主要提呈脂类、糖脂类抗原给自然杀伤性T细胞（NKT）。作为NKT细胞的配体，CD1d多聚体为NKT细胞的相关研究提供了鉴定与功能调控的手段。本研究拟制备人CD1d二聚体（hCD1d二聚体），为后续深入研究NKT细胞奠定基础。本研究主要内容包括：
　　⑴pFastBacTMDual＋［β2m＋CD1d/IgG1-Fc］昆虫杆状病毒表达载体的构建。为了构建pFastBacTMDual＋［β2m＋CD1d/IgG1-Fc］表达质粒，选用本课题组前期已经建立的pFastBacTMDual＋［β2m］质粒作为载体，该载体中P10启动子下游已经重组入正确的人β2m编码基因。应用人CD1d及IgG1-Fc特异性引物分别从人PBMC中扩增hCD1d（α1-α3）与IgG1-Fc（CH1-CH3区）编码基因。通过酶切位点将hCD1d与 IgG1-Fc融合基因插入到 pFastBacTMDual＋［β2m］ Ph启动子下游，获得pFastBacTMDual＋［β2m＋CD1d/IgG1-Fc］表达质粒。经过特异性引物PCR、限制性内切酶酶切和DNA碱基序列测定证实构建的质粒正确插入了目的基因。
　　⑵hCD1d二聚体的表达及鉴定。将携带目的基因的pFastBacTMDual＋［β2m＋CD1d/IgG1-Fc］质粒通过转座作用转入杆状病毒载体，并转染到草地贪夜蛾sf9细胞中。转染后5天收集细胞培养上清，此上清中含有可表达hCD1d二聚体的杆状病毒颗粒。利用此上清继续感染细胞，对感染每一代病毒的细胞上清进行hCD1d二聚体水平检测，结果显示感染第四代病毒的细胞上清中hCD1d二聚体表达量最高。收集感染第四代病毒的细胞上清，用特异性的抗体进行ELISA及Western-Blot检测鉴定。结果证实获得具有正确构象与分子量的hCD1d二聚体。
　　⑶hCD1d二聚体的纯化。由于hCD1d二聚体含有IgG1-Fc片段，本研究利用金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）对hCD1d二聚体进行纯化。然而实验显示传统的洗脱液（pH4.5的0.1M甘氨酸）不能有效的洗脱hCD1d二聚体。比较pH2.5的0.1M甘氨酸、pH2.5的0.5M甘氨酸、pH2.5的1M甘氨酸、pH2.5的0.1M乙酸、pH1.9的0.1M盐酸和pH2.5的0.1M柠檬酸等六种不同洗脱液洗脱效果，结果显示pH2.5的0.1M柠檬酸洗脱能够较好的浓缩纯化hCD1d二聚体。
　　⑷HLA-A2二聚体与hCD1d二聚体在纯化过程中的构象稳定性分析。HLA-A2为经典MHC I类分子，本室之前构建表达的HLA-A2二聚体是HLA-A2与IgG1-Fc的融合蛋白。通过比较HLA-A2二聚体与hCD1d二聚体在纯化过程中构象的改变，发现在SPA亲和层析过程中，大部分纯化的hCD1d二聚体中hCD1d与β2m可以维持完整构象（完整构象率％：71.4%±30.1%，n=3），而大部分纯化的HLA-A2二聚体中β2m脱落、导致构象改变（完整构象率%：13.7%±13.7%，n=2）。结果提示hCD1d分子与β2m形成的复合物，在酸性环境中（pH2.5，0.1M柠檬酸），具有比经典MHC I类分子更稳定的构象。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

材料：

方法：

结果

一、pFastBacTMDual＋［β2m＋CD1d/IgG1-Fc］表达质粒的构建

二、hCD1d二聚体的表达与鉴定

三、hCD1d二聚体的纯化

四、hCD1d二聚体与HLA-A2二聚体在纯化过程中的构象稳定性分析

讨论

一、hCD1d二聚体的构建与表达

二、hCD1d二聚体的纯化方法的建立及其在纯化过程中的构象稳定性分析

小结

参考文献

综述: CD1d分子研究进展

英文缩略词表

致谢