真核表达hCD1d二聚体的纯化及其对iNKT细胞的刺激效应

摘要

目的 建立真核表达的人CD1d(hCD1d)二聚体的纯化方法,并制备人工抗原提呈细胞,研究其对iNKT细胞的刺激效应.方法 提取pFastBacTM Dual+β2 m+ CD1d/IgG1-Fc]昆虫杆状病毒质粒并转染至sf9细胞中,收集病毒感染上清,通过ELISA法鉴定融合蛋白中人IgG-Fc、人CD1d和人β2m等组分并测定hCD1d二聚体浓度.探索保持hCD1d二聚体完整构象的亲和层析条件,对hCD1d二聚体进行纯化和浓缩.应用加载α-GalCer的hCD1d二聚体制备人工抗原提呈细胞刺激健康个体外周血单个核细胞(PBMC),检测Th1、Th2、Th17细胞因子分泌水平与iNKT细胞的扩增效率.结果 收集的第4代病毒感染上清中目的蛋白表达量较高.抗Ig-Fc抗体ELISA、抗CD1d抗体与抗β2m抗体双抗夹心ELISA检测显示sf9细胞表达的hCD1d二聚体构象正确,两种方法检测的蛋白浓度分别为(1.05±0.20)μg/mL和(0.85±0.01)μg/mL.亲和层析纯化结果显示用pH2.5的0.1 mol/L柠檬酸可较好地实现hCD1d二聚体有效纯化.健康个体iNKT细胞经人工抗原提呈细胞刺激3d后主要产生Th1型细胞因子,上清中IFN-γ、TNF-α含量分别为(1876.26±96.73) pg/mL和(1186.25±98.63) pg/mL,明显高于对照组(79.98±18.52) pg/mL和(29.96±4.43)pg/mL,差异具有统计学意义(均P＜0.01),其余Th2型(IL-4)、Treg型(IL-10)和Th17型(IL-17)细胞因子未见明显升高,差异均无统计学意义(均P＞0.05),与iNKT细胞接收刺激后分泌细胞因子谱基本一致.健康个体PBMC接受刺激后,iNKT细胞迅速扩增,刺激第7天iNKT细胞占PBMC(4.17士0.76)％,而未包被hCD1d二聚体的微球对照组iNKT细胞占PBMC的比例仅为(0.41±0.09)％.这些结果说明包被有hCD1d二聚体的人工抗原提呈细胞可特异性地刺激iNKT细胞分泌Th1型细胞因子并有效扩增.结论 成功制备hCD1d二聚体,并建立基于人工抗原提呈细胞的iNKT细胞有效的刺激与扩增体系,为后续对iNKT细胞深入研究打下了基础.