IFN-λ促进HepG2.2.15细胞中HBVcccDNA的降解及其机制研究

摘要

目的：
　　截止至2014年，全球范围内感染HBV（乙型肝炎病毒）的人数达到了2.4亿，每年约有650万人死于乙肝及其相关疾病。目前广泛应用于临床治疗 HBV的药物主要有：核苷类似物和干扰素。前者虽然能够明显降低患者血清中的病毒滴度，但其疗程长、耐药率高、费用高、副作用大，且不能完全清除乙肝病毒。虽然，I型干扰素在临床的应用获得了一定的疗效：可使不到10%的HBeAg阳性患者出现临床治愈（乙肝表面抗原血清学转换），但由于其低治愈率、广泛而严重的副作用，加之高昂的治疗费用，使得新药的开发迫在眉睫。
　　III型干扰素和I型干扰素均能通过JAK-STAT信号通路调节免疫应答，并具有抗病毒作用和抑制肿瘤细胞增殖的作用。与I型干扰素不同，III型干扰受体分布的分布具有组织特异性，因此，III型干扰素的副作用明显少于I型干扰素。且， IFN-λ在 HCV的治疗已证明其安全性。Protzerl已证实 IFN-α可通过上调APOBEC3A的表达，使得HBV cccDNA脱氨基，形成AP位点。富含AP位点的cccDNA会被核酸裂解酶识别并降解。同时，已有学者证实IFN-λ用于HBV的临床治疗效果不亚于I型干扰素，为IFN-λ清除HBV cccDNA提供了理论依据。HepG2.2.15是稳定表达HBV基因组的稳转细胞系，能够产生有活性的乙肝病毒和HBV cccDNA、 HBsAg及HBeAg等乙肝病毒复制指标，可在体外作为抗乙肝药物研究的细胞模型。
　　本研究拟以HepG2.2.15细胞为产生HBV cccDNA的细胞模型，建立HBV cccDNA特异性检测方法，研究IFN-λ是否能降解HBV cccDNA，并初步探究其作用机制，为IFN-λ用于临床治疗慢乙肝提供理论依据。
　　方法：
　　1、体外培养 HBV二倍体基因稳定转染细胞系 HepG2.2.15，并使用质粒小提试剂盒提取细胞中HBV cccDNA。使用MBN酶解单链DNA，以纯化cccDNA；设计跨缺口引物，用于特异性扩增HBV cccDNA。使用从HepG2.2.15培养上清中提取的DNA检测该方法的特异性。
　　2、使用pHBV1.3质粒建立标准品（pHBV1.3由本实验室保存），用于实时定量PCR检测从HepG2.2.15细胞中提取并纯化后的HBV cccDNA的浓度。
　　3、使用 Real time-PCR方法检测对照组、IFN-α干预组和 IFN-λ干预组中HepG2.2.15细胞的cccDNA含量变化及细胞培养上清中HBV-DNA的水平变化。
　　4、使用ELISA检测三组（对照组、IFN-α组和IFN-λ组）细胞培养上清中乙肝表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的水平变化。
　　5、Real time-PCR检测IFN-α和IFN-λ干预组HepG2.2.15细胞于6h、12h、24h、48h、72h时其HBV复制指标水平的变化，及A3A、A3B、A3G、IRF3、IRF7、IRF9等基因表达水平的差异。
　　结果：
　　1、从HepG2.2.15细胞中提取出来HBV cccDNA，经PCR鉴定，与pHBV1.3质粒对照组扩增条带的位置一致。送Tsingke测序结果显示，与cccDNA上1562-1883间序列完全一致。
　　2、建立HBV cccDNA特异性定量检测方法，并且HBV cccDNA在HepG2.2.15细胞中具有良好的稳定性。
　　3、检测乙肝病毒复制指标：HBV cccDNA、HBV DNA、HBsAg、HBeAg。三组之间存在明显差异：与IFN-α类似，IFN-λ可抑制HBsAg、HBeAg和HBV DNA的产生，降低HBV cccDNA的水平，且其作用效果较IFN-α组更为明显。
　　4、通过检测6h、12h、24h、48h、72h等时间点的A3A、A3B、A3G、IRF3、IRF7、IRF9的mRNA水平。分析结果发现，上述指标在IFN-α干预组与IFN-λ干预组的变化曲线存在明显差别。在6h、12h、24h时，APOBEC3A的mRNA水平未见明显差异。48h后，IFN-λ可明显上调HepG2.2.15细胞中APOBEC3A的mRNA水平。IFN-α与IFN-λ均能上调APOBEC3B的mRNA水平。
　　结论：
　　1、HepG2.2.15细胞可生成HBV cccDNA，并用于抗乙肝药物对HBV cccDNA作用的体外研究。
　　2、MBN可水解单链DNA，从而将rcDNA的单链部分水解，但对cccDNA无损伤，可用于纯化HBV cccDNA。特异跨缺口引物可以选择性扩增HBV cccDNA的片段，对HBV cccDNA定量检测，该方法具有特异性。
　　3、与IFN-α类似，IFN-λ可显著降低HepG2.2.15.细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的水平和HBV DNA的滴度，同时还促进细胞核中HBV cccDNA的降解。但IFN-λ的作用效果比IFN-α更为明显，且二者在48h后作用都明显增强。
　　4、在干扰素刺激72h内，IRF3的基因水平未见明显组间差异。而IRF7则在两组干预发生后的72h出现了明显上调。而对于IRF9，IFN-α刺激后的6h即可见明显高峰，但IFN-λ刺激所引发的峰值较前者明显减低，且明显延迟。
　　5、IFN-λ可通过上调A3A蛋白的表达，使得cccDNA脱氨基，在HBV cccDNA中形成大量AP位点。含有大量AP位点的cccDNA容易被核酸裂解酶识别并降解。从而使得HepG2.2.15细胞核中HBV cccDNA水平明显降低。
　　创新点与不足：
　　1、根据HBV cccDNA的结构特征及HBV cccDNA与HBV rc-DNA之间的结构差异，成功建立了HBV cccDNA的提取方法、纯化方法及定量检测体系；
　　2、根据IFN-λ与IFN-α作用信号通路的相似性，探究IFN-λ的抗病毒机制，从分子水平证实了IFN-λ降解cccDNA的作用机制；
　　3、分组中缺少IFN-α与IFN-λ联合作用组；
　　4、仅进行了体外实验，未能从体内实验证实上述机制的有效性，有待进一步完善。

目录

声明

英文缩写及中文对照

引言

参考文献

第一部分：HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA检测方法的建立

1、实验材料

1.1 细胞系、病毒、质粒

1.2主要试剂及耗材

1.3主要仪器及设备

1.4试剂配制

1.5引物序列

2、实验方法

2.1细胞的复苏、传代及冻存

2.2 IFN-λ与IFN-α抗EMCV效价比的测定

2.3 HBV cccDNA检测方法的建立

2.4 IFN-λ在HepG2.2.15细胞对HBV cccDNA的影响

3 结果

3.1 HBV cccDNA检测方法特异性

3.2 定量检测体系的建立

3.3 使用HBV cccDNA特异性检测方法检测HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的水平

3.4 检测HepG2.2.15细胞在维持培养过程中上清中HBsAg和HBeAg水平变化

4讨论

参考文献

第二部分 IFN-λ降解HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的作用机制

1 实验材料

1.1 实验中所用细胞系

1.2 主要试剂及厂家

1.3 试剂配制

1.4 仪器及设备

1.5 定量PCR中引物序列

2实验方法

2.1 HepG2.2.15细胞的复苏、传代及冻存。方法同第一部分。

2.2 细胞的培养及分组

2.3 RNA的提取及稀释

2.4 细胞上清的收集、HBV DNA 定量检测方法、HBsAg、HBeAg检测方法同第一部分。

2.5 RNA的定量检测（使用TAKARA 1步法检测试剂盒）

3 结果

3.1 IFN-α与IFN-λ对HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA水平的影响

3.2 IFN-λ和IFN-α干预HepG2.2.15细胞后6h、12h、24h、48h、72h时乙肝病毒复制指标水平的变化

3.3 IFN-λ和IFN-α干预HepG2.2.15细胞后6h、12h、24h、48h、72h时APOBEC3家族基因表达水平的变化

3.4 IFN-λ和IFN-α干预HepG2.2.15细胞后6h、12h、24h、48h、72h时IRF家族基因水平变化

4 讨论

参考文献

综述:HBV cccDNA 的研究进展

致谢