基于TPGS的纳米脂质体共输送阿霉素和Bcl-2siRNA逆转肿瘤多药耐药

摘要

化疗，或化疗与放疗联用，以及化疗联合手术切除是目前治疗肿瘤的主要手段。然而，想要成功治愈肿瘤最大的困难在于肿瘤细胞会对化疗药物产生多药耐药(multidrug resistance, MDR)。研究表明，肿瘤MDR的发生通常是多种耐药机制共同作用的结果，仅通过抑制单一细胞耐药途径无法有效克服肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的问题。药物外排泵和细胞抗凋亡抵御机制是造成肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的最重要的两种MDR机制。因此，能够兼具传递化疗药物并可有效抑制多种耐药途径的多功能药物传递系统是治疗肿瘤多药耐药性的优先选择。
　　TPGS作为一种极佳的P糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）抑制剂，可以有效抑制P-gp介导的药物外排。相关文献报道，共输送Bcl-2 siRNA和Dox可以发挥协同抗肿瘤作用，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进肿瘤细胞凋亡，一定程度上克服MDR。本文工作基于国家纳米药物工程技术研究中心在脂质体纳米载药系统多年研究基础上，制备了基于TPGS的阳离子脂质体共输送Bcl-2 siRNA和阿霉素（Doxorubicin, Dox）(siRNA-Dox/TPGS-LPs)来克服肿瘤MDR。完成了siRNA-Dox/TPGS-LPs的各种理化表征，体外释放行为，TPGS对于肿瘤耐药细胞对 Dox摄取的影响，Dox的胞内滞留曲线，以及体外抗肿瘤实验和凋亡诱导实验。本文的主要研究结果如下：
　　（1）在阳离子脂质体 Dox-TPGS-LPs的基础上发展出共输送纳米脂质体siRNA-Dox/TPGS-LPs，并进行了相关表征。siRNA-Dox/TPGS-LPs的平均粒径为209.9，PDI为0.112，Zeta电位为+11.8 mV，Dox的包封率为95%以上。体外释放结果显示，Dox-LPs, Dox-TPGS-LPs和siRNA-Dox/TPGS-LPs均呈现出稳定持续地释放直至48 h，释放试验进行48 h后，Dox-TPGS-LPs和siRNA-Dox/TPGS-LPs的累积释放百分比分别为86.6%和81.7%，无显著性差异。
　　（2）研究了不同Dox制剂处理Bel7402和Bel7402/5-FU细胞后Dox的入胞量。细胞对Dox的摄取结果显示TPGS可以通过抑制Bel7402/5-FU细胞表面的P-gp介导的药物外排来增加Dox的胞内蓄积，但并未增加Bel7402细胞对Dox摄取量。进一步研究了Dox在Bel7402和Bel7402/5-FU细胞内滞留行为。胞内滞留结果显示，在Bel7402/5-FU细胞中，Dox-TPGS-LPs组Dox的胞内滞留效率显著高于Dox-LPs组。研究了siRNA-Dox/TPGS-LPs递送siRNA和Dox至Bel7402/5-FU细胞的胞内分布。Dox和siRNA的共定位结果表明，基于TPGS的多功能脂质体siRNA-Dox/TPGS-LPs可以实现Bel7402/5-FU细胞内siRNA和Dox的同时高效传递。
　　（3）开展了 siRNA-Dox/TPGS-LPs的细胞凋亡诱导实验和体外细胞毒性实验。Annexin V-FITC/PI凋亡双染结果显示，siRNA-Dox/TPGS-LPs可以发挥协同作用促进Bel7402/5-FU细胞的凋亡。MTT结果显示，TPGS对Bel7402细胞并未表现出细胞毒性增敏作用，但对Bel7402/5-FU细胞的毒性作用通过抑制P-gp的外排而显著增强。相比于Dox-TPGS-LPs的耐药指数（RI）为4.27，siRNA-Dox/TPGS-LPs的耐药指数（2.00）降低了2.1倍，表明Bcl-2 siRNA可以通过下调Bcl-2蛋白表达表现出更好的肿瘤细胞MDR逆转效果。
　　本论文的研究表明，siRNA-Dox/TPGS-LPs发挥协同作用，显著提高了对肿瘤细胞的MDR抑制效果；其作用机制是siRNA-Dox/TPGS-LPs可以同时抑制P-gp外排和促进细胞凋亡，从而逆转MDR。以上结果将为开发新型多种药物共输送纳米传递系统逆转肿瘤MDR提供了坚实的实验依据。

目录

声明

1 绪 论

1.1 引言

1.2肿瘤多药耐药性研究进展

1.3共输送纳米载药系统研究进展

1.4 本文的研究目的及主要研究内容

2 siRNA-Dox/TPGS-LPs共输送纳米脂质体构建与表征

2.1 引言

2.2 仪器与试剂

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

3 siRNA-Dox/TPGS-LPs入胞行为研究

3.1 引言

3.2 仪器与试剂

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

4 siRNA-Dox/TPGS-LPs逆转肝癌细胞MDR研究

4.1 引言

4.2 仪器与试剂

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

5 全文总结

5.1 论文的主要研究结果

5.2 论文的创新之处

5.3 展望

致谢

参考文献

附录1 攻读硕士学位期间完成的论文

附录2 主要缩写词表（按字母顺序排列）