基因特异表达检测工具开发及其在石斛改善糖尿病机制研究中的应用

摘要

特异表达基因是在特定环境下有着特殊表达模式的基因，它们可以作为特定生命活动和疾病发生发展的重要推动分子或者分子标志物。尽管目前有一些方法检测高通量转录组数据中的特异表达基因，然而还存在较多的不足。本研究中，我们首先开发了用于在高通量RNA-Seq转录组数据中检测特异表达基因的R工具包并应用于人类组织和单细胞测序数据中，分析不同组织中的特异表达基因。石斛，作为我国的传统中草药，被认为具有抗炎和抗氧化的作用。我们的合作者发现石斛提取物对改善糖尿病的症状具有良好的功效，但其中的分子机制还不清楚。我们在大鼠糖尿病模型中研究石斛提取物对糖尿病的改善作用，并使用转录组和小RNA测序探索石斛提取物缓解糖尿病症状的分子生物学机制。在本研究中取得的重要结果如下： 第一，我们开发了基于改进的模糊c均值算法、Jaccard指数以及贪婪退火算法的流程来检测特异表达基因，并将此流程用R语言编写了工具包SEGtool。SEGtool可以自动检测特异表达基因，具有自适应、高精度和特异性等特点，并提供了用户友好的输出结果。SEGtool对特异高表达及特异低表达的基因均具有同样的敏感性，因此可以无偏移地检测两个不同模式下的特异表达基因。通过与现有主流的4种特异表达基因检测方法/工具进行比较发现，SEGtool在5种方法中综合检测效能最优，且在计算资源需求方面较为平衡。 第二，我们将SEGtool分别应用在人类组织表达的GTEx数据集、单细胞数据集上进行了特异表达基因的检测分析。在GTEx数据集的53个组织中检测到了3184个特异表达基因，其中在血液样本里特异低表达基因数目最多，而在睾丸、肝脏及大脑的特异高表达的基因数目较多。在血液里检测到的158个特异低表达基因主要富集在能量代谢相关的通路，这可能与红细胞缺乏细胞核和大部分的细胞器有关。睾丸、肝脏及大脑中特异表达基因的功能富集分析发现其功能大部分都与其组织特异性相关，这和我们的预期较为一致。特异表达的转录因子可能对特异表达基因的调控有较大贡献，如大脑中29调控218个特异表达基因。基因共线性分析发现，特异表达基因在基因组上也有紧密线性排列的现象。SEGtool在不同的胚胎发育阶段和胚胎细胞中的单细胞转录组数据中检测到1478个特异表达基因，其大部分都富集在了细胞发育和转录调节，部分特异高表达基因如TOX3、SALL2、TERF1等被证实是胚胎发育和胚胎细胞的标志物。这些结果表明，SEGtool在常规组织以及单细胞表达数据集上均有良好的检测效能。 第三，我们验证了石斛提取物在糖尿病大鼠模型中能缓解糖尿病症状，为了解释其分子机制，我们对正常、糖尿病模型以及石斛喂养后的糖尿病模型大鼠的胰腺和肝脏进行转录组和小RNA表达谱分析，然后进行了实验验证。同时，使用SEGtool对这部分样本进行特异表达基因检测发现，在每个处理中均存在大量特异表达的长非编码RNA，这暗示石斛对糖尿病的缓解机制中可能涉及长非编码RNA的调控。另一方面，我们发现，地塞米松注射协同高脂喂养不仅引发了大鼠胰腺严重的炎症反应并导致胰岛β细胞的凋亡，还造成了肝脏中糖脂代谢的紊乱及脂肪的堆积，同时影响了肝脏组织的自我更新。而石斛提取物有效抑制了IFN-γ–STAT1–IL-17R和IL-1β–NF-κB–IL-17R凋亡反馈环，阻断糖尿病状态下β细胞凋亡相关的多条信号通路，从而达到恢复体内胰岛素含量、降低血糖的功效。转录因子与miRNA共调控网络分析表明，miR-375/148在石斛提取物调节炎症诱导的β细胞凋亡方面起到了重要的作用。同时，石斛提取物改善了肝脏的糖脂代谢和组织再生，通过上调与脂类代谢与转运、线粒体氧化还原及组织再生等相关通路的基因，抑制糖尿病状态下肝脏的糖异生、促进脂类物质的代谢及转运、减少了肝细胞脂肪的积累，从而减弱了脂毒性导致的细胞凋亡及恢复了肝脏的自我更新。转录因子和miRNA的共调控可能在这个过程中起到了重要作用，例如Srebf1/Nr1h4/Etv6/Atf5/Klf9/13等转录因子做为核心元件调控肝脏的糖脂代谢和脂类积累，而miR-122/128/143/146a/192等miRNA调控了这些转录因子以及其他靶基因的表达。 本研究开发了检测特异表达基因的工具，并在相关数据集中进行了组织特异表达和胚胎发育特异表达基因的分析。通过对石斛提取物改善糖尿病症状的关键通路分析，探索并验证了石斛提取物作用于糖尿病的分子机制和调控网络，为阐明石斛提取物改善糖尿病症状的分子机制提供了有力支撑。

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