VC模型睾丸微环境改变诱导PK2表达介导的初级精母细胞凋亡机制研究

摘要

本文从以下几方面进行论述： 第一部分 建立wistar大鼠精索静脉曲张模型，分析睾丸组织结构、氧化应激指标和精液参数的变化 目的:建立Wistar大鼠的精索静脉曲张模型组和假手术对照组，比较VC模型组和假手术对照组之间睾丸组织结构、氧化应激指标MDA/SOD、精子数目、精子活力等之间的差异 方法:左肾静脉半结扎法构建wistar大鼠精索静脉曲张模型，未结扎组为假手术对照组，通过HE睾丸组织切片染色比较模型组和对照组睾丸结构的差异，取新鲜睾丸组织根据MDA和SOD试剂盒步骤进行试验，酶标仪检测VC组和假手术组睾丸组织中MDA、SOD的含量；取附睾尾部精子，光学显微镜下用血球计数板计算vc模型组和假手术对照组精子的总数目以及统计随机三个视野内各200个精子的前向运动能力、非前向运动能力和静止不动的精子比例。 结果:VC模型组睾丸组织结构评分低于对照组，且睾丸组织SOD含量高，而MDA含量低，且VC组精子前向运动能力较弱，静止的精子数量比例大。 结论:精索静脉曲张疾病可通过产生氧自由基和活性氧等破坏雄性大鼠睾丸的正常生理结构和功能，引起精子数目及活力的异常，从而降低生育能力，与其它相关报道一致. 第二部分 PK2、PKR1在精索静脉曲张模型与假手术组大鼠睾丸模型中表达差异 目的:比较精索静脉曲张模型组与假手术对照组睾丸组织中PK2、PKR1的表达水平。 方法:取睾丸组织石蜡切片进行免疫组化，检测PK2和PKR1在睾丸组织内细胞上的定位；提取睾丸组织RNA和蛋白，对比模型组和假手术组PK2、PKR1分别在mRNA和蛋白水平的变化。 结果:PKR1和PK2均表达于睾丸组织的初级精母细胞中，PK2也可表达于精子细胞中，且精索静脉曲张大鼠模型组与假手术组对比发现，PK2和PKR1的mRNA和蛋白表达均升高。 结论:PK2和PKR1在精索静脉曲张疾病中表达均升高，可能参与调节初级精母细胞的生理功能。 第三部分 分离成年大鼠睾丸原代初级精母细胞 目的:PK2和其受体PKR1蛋白主要在初级精母细胞中表达，为了针对性的研究初级精母细胞中PK2蛋白的作用，从而分离成年雄性大鼠睾丸的原代初级精母细胞，由于现有方法仅适合于幼龄小鼠睾丸生精细胞的分离，无文献报道大鼠睾丸生精细胞分离的最佳方法，因此我们利用三种不同的方法同时分离成年大鼠的原代初级精母细胞，从中选取最高效、便捷和经济的方法以便进行后续的实验研究。 方法:本课题采用BSA密度梯度沉降法、流式细胞分选术和淘洗离心法等分离成年wistar雄性大鼠睾丸的原代初级精母细胞，其中BSA密度梯度沉降法所使用的装置为自制玻璃仪器。 结果:BSA密度梯度沉降法操作简便、仪器配置费低廉，虽实验过程中外界干扰因素对实验结果影响较大，但综合分离细胞的纯度及实验操作和成本考虑，为最佳的分离方法；流式细胞分选术分离细胞得到的细胞种类最多，且纯度最高，但分选费用过高，并且分选前对细胞染色会影响细胞的活性，不利于后续实验进行，因此作为次选方案；淘析离心法是较为古老的分离方法，70年代即被发明使用，但是由于机器操作复杂，细胞上样量要求大且分离后细胞易受机器转速的冲击而破碎，故不作为常规的分离方法。 结论:综合分离的细胞纯度、仪器的费用和操作的简便性等多方面考虑，BSA沉降法为最优的分离方法。 第四部分 PK2过表达促进初级精母细胞系GC-2的凋亡 目的:体外初级精母细胞培养的存活时间不超过3天，因此不利于体外干预实验的进行，所以我们选择初级精母细胞系GC-2进行进一步的体外干预实验。本部分实验旨在模拟精索静脉曲张疾病睾丸中高氧化应激的微环境，体外H2O2干预GC-2细胞系，是否与体内实验相符？由于在脑卒中和心肌梗死等与血管病变相关的疾病模型中，均可检测到表达升高的PK2蛋白，且PK2蛋白体外可诱导神经元细胞和心肌细胞的分化及凋亡，另一方面，在VC等病理条件下，PK2表达升高于睾丸的初级精母细胞中，那么初级精母细胞中过表达PK2对GC-2的生理状态是否会产生与脑卒中和心肌梗死疾病模型同样的效应？ 方法:H202体外干预GC-2细胞，检测PK2mRNA和蛋白的表达，另外过表达PK2于GC-2细胞，流式细胞术检测GC-2是否发生凋亡，WB进一步检测凋亡相关因子caspase3、caspase8、bcl-2、bax等的变化。 结果:H2O2体外干预GC-2细胞6h，可引起GC-2细胞的凋亡，同时PK2蛋白表达上调，脱离H2O2环境，单独用PK2质粒过表达于GC-2细胞系，流式细胞凋亡术检测发现GC-2细胞的早期和晚期凋亡率均升高，且caspase3、caspase9、bcl2和bax等相关凋亡因子也发生变化。另外，PK2过表达后细胞内的钙离子升高，进一步的凋亡机制有待于探究。 结论:PK2过表达可诱导GC-2细胞发生凋亡，可能是通过激活钙离子内流引起。

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