基于胎儿特异性mRNA–SNP标记进行无创性产前亲权鉴定的探索研究

摘要

由于社会开放性不断提高，涉及产前亲权鉴定的案例越来越多，目前常采用有创的抽取羊水进行鉴定，因此存在着流产、胎儿损伤等风险，而且还受孕龄限制。因此，如何以非侵入性方式获取胎儿有效成分一直是法医学研究的热点，直到孕妇外周血中cffDNA的发现，才真正为探索无创性产前亲权鉴定（NIPPT）指明了方向。相较于传统的侵入性方式获取胎儿成分，直接从孕妇外周血中获取胎儿成分具有安全、灵活等特点，基本排除对胎儿损伤的可能。目前，由于大量母亲成分的干扰，直接利用孕妇外周血中cffDNA获取胎儿分型，大多数为母-胎的混合基因型，难以进行亲权鉴定。后续的研究发现孕妇外周血中存在有cffmRNA，为探索NIPPT提供了提供了另一条途径。cffmRNA出现时间早，最早可在怀孕第4周的孕妇外周血中检出；以一种亚细胞微粒形式存在，比较稳定；在分娩后24h或更短时间内被快速清除；非孕男女血浆均未检出等特性。相较于cffDNA，cffmRNA为胎儿特异性表达，不受母亲成分干扰，是进行NIPPT的理想生物标记。亲权鉴定需要进行遗传标记分型，常用的遗传标记有STR和SNP。STR标记基本位于基因组非编码区，因此不适用于cffmRNA分型标记。SNP是人类基因组中含量最丰富的DNA序列多态性，具有分布广泛、稳定性高和适用于短片段分型等特点，且已有学者成功对cffmRNA进行SNP分型。因而选择SNP作为cffmRNA分型标记。综上所述，基于孕妇外周血浆中cffmRNA的胎源特异性，孕妇外周血浆中cffmRNA联合SNP标记为探索NIPPT提供了新思路。 目的:探索利用孕妇外周血浆中胎儿特异性mRNA联合SNP标记进行无创性产前胎儿亲权鉴定的可行性。 方法：（1）查阅相关文献，筛选出可用于无创性产前亲权鉴定的孕妇外周血浆中胎盘来源的胎儿特异性mRNA。（2）根据从文献中筛选出的候选胎盘来源的mRNA和染色体位置，进入NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）基因组浏览器获取候选mRNA对应的基因参考序列。（3）进入NCBI1000Genomes Browse，以中国南方汉族人群（Han population in southern China,CHS）最小等位基因频率≥0.15为筛选标准，获取候选mRNA区域内的高多态性SNP位点，作为候选mRNA-SNP标记。（4）根据获取的mRNA基因序列,应用Primer3和AutoDimer软件分别设计和检验DNA–PCR、mRNA–PCR引物以及DNA与mRNA共用的单碱基延伸反应引物。（5）两步法RT–PCR联合SNaPshot技术，验证筛选出的胎盘来源mRNA的特异性。（6）针对特异性mRNA–SNP位点，以DNA为模板，建立SNaPshot检测体系，调查其在湖北汉族人群中基因频率分布，获取生父、母和羊水DNA–SNP分型。（7）采集孕中期孕妇外周血，TRIzol?LS Reagent联合RNeasy?Mini Kit法提取纯化血浆游离总RNA，两步法RT–PCR联合SNaPshot技术检测靶SNP位点的基因型，并将此分型结果与生父、母、胎儿分型比对，验证SNP分型的准确性和检测体系的稳定性。 结果：（1）9个候选mRNA（CRH、βhCG、PLAC4、KISS1、CD19、TFPI2、DHRS3、CSHL1、KIR3DL2）均为胎盘来源的胎儿特异性mRNA。（2）成功构建9个mRNA–PCR复合扩增体系和SNP复合检测体系，9个SNP（除KIR3DL2rs652188外）在湖北汉族人群中均检出较好的遗传多态性。（3）孕中期孕妇外周血浆cffmRNA–SNP分型与胎儿完全一致。 结论：孕妇外周血浆中胎儿特异性mRNA联合SNP标记可用于无创性产前胎儿亲权鉴定。

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